Extraccion Purificacion Y Estudio Cinetico De La Ureasa De La Soja

TRABAJO PRACTICO DE LABORATORIO Nº 2

Extracción, purificación y cinética de ureasa de soja

Objetivos
* Aislamiento y purificación parcial de la ureasa de semilla de soja.
* Estudio cinético de la enzima.

Introducción
La ureasa es una enzima con peso molecular igual a 485.000D y un pI aproximado a 5. Podemos encontrarla en plantas leguminosas, microorganismos, estómago, hígado yotros órganos de animales superiores.
Cataliza la siguiente reacción:
NH22CO+ H2O ureasa 2NH3+ CO2

Las técnicas que usaremos son: extracción y separación de material biológico, cromatografía (PAGE SDS), y espectrofotometría.
CUANTIFICACION DE PROTEINA
El práctico comienza con la construcción de una curvas de calibración de Absorbancia en función de los µg de proteínas, de las queconoceremos el valor de ε para posteriores análisis.
Para medir la absorbancia de las muestras y luego calcular la cantidad de proteína y de NH3 utilizamos un espectrofotómetro.
Nota: con un espectrofotómetro medimos la cantidad de luz en un rango determinado sobre la región visible.
Consta de una fuente de luz, un monocromador que permite seleccionar la longitud de onda de trabajo, un recipientepara contener la muestra que llamamos celdas eppendolf (material transparente de vidrio o plástico), un detector de luz transmitida.
Dosaje de proteínas
Método de Bradford:
Mide cantidad de proteínas, la diferencia con otros métodos espectrofotométricos es la sensibilidad(microgramos) que es la mínima cantidad de la muestra que puede detectar.
Bradford se basó en el uso de un colorantellamado Comassie Blue Brillant G-250 (CBB G-250), que reacciona en medio ácido con las proteínas dando un color azul que se lee a 595nm. Es una fotometría indirecta.
Curva de calibración N° 1
Reactivos: para la solución colorante se disuelve el CBBG (60mg) en 50mL de etanol y se lleva a un litro con ácido perclórico al 3%, se deja reposar por 2hs por lo menos y se ajusta la absorbancia a 1,3-1,5 a595nm con agua destilada.
Solución patrón de albumina 0,1 mg/ml.
Preparamos 6 tubos (incluyendo el blanco) de concentraciones crecientes, utilizando como solución patrón ALBÚMINA.
Tubos | Albúmina(ml) | Buffer(ml) | Reactivo de Bradford | Absorbancia (595 nm) | μg de albúmina |
Blanco | - | 2 | 2 | - | - |
1 | 0,2 | 1,8 | 2 | 0,151 | 20 |
2 | 0,4 | 1,6 | 2 | 0,253 | 40 |
3 | 0,6 |1,4 | 2 | 0,308 | 60 |
4 | 0,8 | 1,2 | 2 | 0,372 | 80 |
5 | 1 | 1 | 2 | 0,397 | 100 |

Medimos a con el espectrofotómetro utilizando una absorbancia a λ=595 nm.
Con los resultados que obtendremos realizaremos una curva para determinar la cantidad de proteína (medida en μg) en función de la absorbancia.

Para la determinación de las concentraciones utilizamos la Ley de Lambert y Beer queestablece:
A= εcb
Donde:
* A: absobancia
* ε: coeficiente de extinción molar
* C: concentración de la disolución coloreada.
* b: espesor que atraviesa la luz

El valor valor de ε obtenido con los datos usados por los miembros de nuestro grupo en el laboratorio fue el mostrado en la gráfica. Cabe resaltar que usaremos el dato de los chicos del otro grupo debido a que se tienemenos error. Entonces el valor que tendremos en cuenta PARA LA DETREMINACION DE CANTIDAD DE PROTEINA ES :
ε=0,005 ±0,0004 µg-1cm-1

Curva de calibración N° 2
Determinación de amoniaco: el método se basa en que el ion amonio alcalino se transforme en amoniaco:
NH4++ OH- NH3 + H2O
NH3 + NaClO+Fenol nitroprusiatode sodio Indofenol

Reactivos:
-Solución patrón: sulfato de amonio(NH4)2SO4 0,4mM.
-Solución A: 10g de fenol+ 50mg de nitroprusiato de sodio, se lleva a volumen final de 1L con agua destilada.
-Solución B: 5g de NaOH + 10mL de hipoclorito sódico concentrado, se lleva a 1L con agua destilada.
Se preparan 6 tubos incluyendo al blanco con concentración creciente patrón. el tubo al que rotulamos con el numero “6” es un ejercicio extra (tubo problema) al que...