Extraccion y cuantificacion de scarasa

Extracción y cuantificación de la enzima sacarasa.

Introducción.
La invertasa o sacarasa (β-D-fructofuranosidasa, β-D-fructofuranósido fructohidrolasa, cataliza la hidrólisis de restos terminales no reductores β-Dfructofuranosídicos de fructofuranósidos. Entre los sustratos sobre los que actúa el más significado es, sin duda, la sacarosa, de ahí que el enzima se designe con el nombre desacarasa. La denominación trivial de invertasa, con la que también se conoce, hace referencia al hecho de que los productos de la reacción son conocidos desde antiguo como “azúcar invertido” ya que mientras la sacarosa es dextrorrotatoria, la mezcla equimolecular de glucosa y fructosa que resulta de su hidrólisis es levorrotatoria, por lo que en el proceso se origina un cambio de signo (de positivoa negativo) del valor de rotación óptica.

Sacarosa ([α]D= +65º) + H2O → D-glucosa ([α]D= +37º) + D-fructosa ([α]D= -92º)
La invertasa es un enzima ampliamente distribuido, estando presente tanto en microorganismos como en animales y vegetales, jugando un papel 1importante en el catabolismo de fructanos y más específicamente en el de la sacarosa, en especial en aquellos organismos en losque dichos azúcares son utilizados como fuente de carbono y energía. El estudio de la actividad invertasa presenta un gran interés tanto desde un punto de vista académico como de investigación aplicada, siendo uno de las enzimas más conocidas. A modo de ejemplo podemos referir que la invertasa fue el primer enzima cuya cinética se estudió en profundidad (estudios clásicos de Michaelis-Menten) yque fue utilizado industrialmente. Para la determinación de la actividad invertasa se utilizará un ensayo indirecto en el que los productos de reacción serán detectados espectrofotométricamente tras su conversión en derivados coloreados. En concreto, la extensión de la hidrólisis enzimática de sacarosa (azúcar no reductor) en glucosa más fructosa (azúcares reductores) se valorará mediante uno delos diversos métodos existentes para la estimación de azúcares reductores. Nos referimos exactamente al método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), el cual se basa en la reducción del DNS (de color amarillo) por la glucosa u otro azúcar reductor al ácido 3-amino-5 nitrosalicílico (de color rojo ladrillo) (Chaplin, 1986), cuya presencia puede detectarse por lectura de la Absorbancia en la zona de540-570 nm.

Objetivos.
Observar y establecer condiciones optimas para la enzima así como pH, temperatura, concentración de sustrato, concentración de enzima, U.R.

Materiales y reactivos.
10 tubos de ensaye.
1vaso de precipitado de 200ml.
1vaso de precipitado de 100ml.
1vaso de precipitado de 20ml.
2 pipetas volumétricas de 5ml, 10ml.
1 pipeta graduada de 5ml.
Goteros.
Matraces deaforo de 50ml.
Pinzas.
Agitador.
Espátula.
Gradilla.
Termómetro.
Micro pipeta.
Frascos contenedores de liquidos.

Equipos.
Balanza analítica.
Centrifuga.
Potenciómetro.
Espectrofotómetro.
Plancha eléctrica.
Refrigerador.

Reactivos.
Levadura de panadería.
Agua destilada.
Reactivo de Benedict.
Tampones de fosfatos: pH=3, 5, 6 y 8.
Tampón de acetato 0.1M, pH=5, en NaCl 0.5M.NaOH.
NaCl.

Procedimiento:
1.- Obtención del extracto crudo de sacarasa de la levadura de panadería.
Suspender 1gr de preparado lofilizado de levadura en 200ml de tampón de extracción (tampón acetato 0.1M, pH 5 en NaCl 0.5M). Agitar la mezcla durante 15min (puede ayudarse la extracción mediante sonificación de la suspensión u homogeneización de la misma), centrifugar y tomar el sobrenadantecomo extracto enzimático. El extracto enzimático, cuando no se esté utilizando, se guardará en frío.
2.- Homogenizar 2.5gr de levadura de panadería en 20ml de agua. Dejar reposar durante 15 min. (Sustrato).
Obtención del pH temperatura óptima de la reacción enzimática de sacarasa con sustrato.
Para obtener el pH óptimo y la temperatura óptima en el cual determinaremos nuestros datos debemos...