Extracción de ADN plasmidico


TP N°2: Purificación de ADN plasmídico.

Introducción:
Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosómico, circular y generalmente de pequeño tamaño que se encuentran en muchas especies bacterianas y que se pueden replicar de manera independiente del DNA cromosómico. A diferencia de éste, los plásmidos no son necesarios para la viabilidad general de la célula, pero pueden contenergenes que contribuyen a la supervivencia en condiciones especiales, como los que confieren resistencia a antibióticos, a metales etc. Algunas clases de plásmidos poseen además la propiedad conocida como "replicación relajada", esto es, están presentes en forma de muchas copias por célula, lo que facilita enormemente su aislamiento y purificación.
Para ser utilizado como vector de clonación, unplásmido ideal debe poseer al menos tres características: 1) Debe tener su propio origen de replicación y por tanto la capacidad de replicación autónoma independiente del genoma del hospedador. 2) Debe tener sitios de clonación múltiple que permitan la apertura del DNA con enzimas de restricción y hace posible la clonación de insertos de DNA en la forma y orientación determinada. 3) Debe poseermarcadores genéticos seleccionables que permitan aislar las células hospedadores que contengan el vector. La mayoría de los plásmidos naturales no cumplen todas estas condiciones, por lo que una primera tarea de la Ingeniería Genética ha consistido en la construcción de plásmidos artificiales, combinando en una misma molécula diversos rasgos útiles procedentes de los plásmidos naturales.
Lapresencia en el plásmido del gen de resistencia a ampicilina permite seleccionar las bacterias que portan estos plásmidos, gracias a su capacidad para crecer en presencia de dicho antibiótico (el gen de resistencia codifica una beta lactamasa, enzima que degrada la ampicilina).
La mayoría de los plásmidos usados en Biología Molecular contienen el sitio de clonación múltiple dentro el gen de laβ-galactosidasa lo que permite la interrupción e inactivación de este gen cuando un DNA inserto se clona en esta región. En medios de cultivo que contengan el análogo de la lactosa X-gal, esta estrategia permite distinguir las colonias bacterias que contienen el vector recombinante (con inserto) de aquellas que han recibido un vector no recombinante (sin inserto). Las bacterias que reciben el vectorrecombinante no pueden utilizar lactosa ni su análogo y formará colonias blancas. Las bacterias que reciben un vector no recombinante sí pueden utilizar la lactosa o su análogo y formarán colonias azules.
La lisis alcalina, en combinación con el detergente Dodecil Sulfato de Sodio, SDS, ha sido usada por más de 20 años para aislar ADN plasmídico de E. coli. La exposición de suspensiones bacterianas adetergentes aniónicos fuertes en valores de pH altos desestabiliza la envoltura celular, desnaturaliza el ADN cromosomal y las proteínas, y libera el ADN plasmídico al sobrenadante. Aunque la solución alcalina separa completamente las bases apareadas del ADN, las hebras de un plásmido circular no se separan completamente unas de otras debido a que están topológicamente entrelazadas. Mientras laintensidad y la duración de la exposición al OH- no sea demasiado larga, ambas hebras del ADN plasmídico se renaturalizarán cuando los niveles de pH retornen a sus valores neutros reconstituyendo una molécula de ADN doble cadena circular.
Durante la lisis, las proteínas bacterianas, la pared celular rota y el ADN cromosomal desnaturalizado constituyen grandes complejos que se agregan y soncubiertos con SDS. Estos complejos son precipitados eficientemente de la solución acuosa cuando los iones sodio son reemplazados por potasio. Después que este material ha sido removido por centrifugación, el ADN plasmídico puede ser recuperado del sobrenadante.
La lisis alcalina en presencia de SDS es una técnica flexible que trabaja muy bien con todas las cepas de E. coli y con cultivos bacterianos...