EXTRACCIÓN DE ADN

PRACTICA N° 7
EXTRACCION DE ADN
MARCO TEORICO
El proceso de extracción del DNA geonómico sigue ciertas pautas para su correcta purificación que son muy diferentes a los empleados en la purificación de proteínas, lo que refleja las diferencias básicas en la estructura de estos dos tipos de macromoléculas.
El primer paso en la purificación del DNA consiste en homogeneizar las células y distarlos núcleos de los cuales se extrae el DNA. El medio de extracción de ordinario contiene un detergente, como el SDS, que sirve para lisar los núcleos y liberar el DNA, hecho que aumenta notablemente la viscosidad de la solución. El detergente inhibe también cualquier actividad nucleasa en la preparación.
El objetivo de los pasos de purificación es separar el DNA de materiales contaminantes, comoRNA y proteínas.
La desproteinización se logra en general agitando la mezcla con un volumen de fenol. El fenol (o alternativamente cloroformo) es un desnaturalizador activo de proteínas que suprime la solubilidad de las proteínas en la preparación y las precipita. Puesto que el fenol y la solución salina amortiguadora no se mezclan, solo se requiere centrifugar la suspensión para separar lasbases, permaneciendo el DNA (y el RNA) en la solución dentro de la fase acuosa de arriba y la proteína presente como un precipitado concentrado en la interface. La fase acuosa se retira y se somete a ciclos repetidos de agitación con fenol y centrifugación hasta agotar toda la proteína de la solución. Añadiendo etanol frío. El etanol frío forma una capa arriba de la solución acuosa del DNA, el cual,se aísla de las demás moléculas conforme sale de la solución.
En la interface el RNA sale de la solución salina.
En contraste, el RNA sale de la solución como precipitados. Luego de este primer paso de purificación, se disuelve el DNA y se trata con ribonucleasa mediante tratamiento con una proteasa.
Enseguida sale la proteasa por desproteinización con fenol y se vuelve a precipitar el DNA.La electroforesis es una de las técnicas mas empleada en bioquímica y biología molecular, usada para separar y a veces purificar macromoléculas, especialmente proteínas y ácidos nucleicos, que difieren en tamaño, carga o conformación.
Cuando las moléculas cargadas son sometidas a un campo eléctrico, migran hacia el polo positivo (ánodo) como es el caso de los ácidos nucleicos o negativo(cátodo) de acuerdo a sus cargas.
Los fragmentos de DNA lineal migran a través del gel de agarosa con una movilidad inversamente proporcional al log10 de su masa molecular, situándose los más pequeños más cerca del polo positivo, adoptando una apariencia similar a un código de barras.
Cada barra contiene un fragmento de ADN de un tamaño determinado más o menos cada 23 pares de bases.
Entre losdiferentes factores que afectan la movilidad de los fragmentos de ADN en el gel de agarosa que pueden optimizarse para la separación de los fragmentos está la concentración de agarosa.

OBJETIVOS
Utilizar unas sencillas técnicas para poder extraer el ADN de un producto natural
Observar la estructura fibrilar del ADN.

MATERIALES
Pipeta
Probeta.
Varilla de vidrio.
Mortero.
Vaso deprecipitado.
Arena.
Trazo de tela para filtrar o gasa.
Alcohol al 96%
Cloruro de sodio 2M.
SDS
Hígado de pollo.







PROCEDIMIENTO:


1. Triturar medio higadito de pollo en un mortero. Añadir arena para que al triturar se puedan romper las membranas de y queden los núcleos sueltos.
2. Añadir al triturado, 50 ml de agua destilada. Remover hasta hacer una especie de papilla o puré.3. Filtrar varias veces sobre una tela para separar los restos de tejidos que hayan quedado por romper.
4. Medir el volumen del filtrado con una probeta.










5. Añadir al filtrado un volumen igual de cloruro sódico 2M. Con esto conseguimos producir el estallido de los núcleos para que queden libres las fibras de cromatina.
6. A continuación se añade 1...