Extracción de ADN


Objetivo:
Utilizar una sencilla técnica para poder extraer el ADN de un tejido animal y por el aspecto que presenta, confirmar su estructura fibrilar. A partir de la longitud enorme de las fibras también se confirma que en el núcleo el ADN se encuentra replegado.
Introducción:
Tejido animal: Una de las principales tendencias en la evolución de animales y vegetales  ha sido la especialización y división del trabajo entre las células componentes. Las que forman el organismo del hombre o del árbol no son todas iguales; cada una se especializa en ciertas funciones. Esta especialización permite que las células trabajen con mas eficacia, pero también significa la dependencia mutua entre las partes del organismo.
El ácido desoxirribonucleico o ADN (DNA) es la molécula que guarda elcódigo genético de todas las células. Sin importar que el organismo sea multicelular o unicelular, eucariota o procariota, todos tienen el DNA como vehículo de su código genético.
Durante el laboratorio de hoy estaremos utilizando un método rápido para aislar DNA a partir de tejidos animales. Este se llama "DNeasy Tissue Kit" y es producido por QIAGEN. Este usa tecnología avanzada de membranas desilicato para purificar rápidamente DNA celular total sin usar extracciones orgánicas ni precipitación con etanol.
El primer paso en la purificación del DNA consiste en homogeneizar las células y distar los núcleos de los cuales se extrae el DNA. El medio de extracción de ordinario contiene un detergente, como el SDS, que sirve para lisar los núcleos y liberar el DNA, hecho que aumenta notablementela viscosidad de la solución. El detergente inhibe también cualquier actividad nucleasa en la preparación.
El objetivo de los pasos de purificación es separar el DNA de materiales contaminantes, como RNA y proteínas.
La desproteinización se logra en general agitando la mezcla con un volumen de fenol. El fenol (o alternativamente cloroformo) es un desnaturalizador activo de proteínas que suprimela solubilidad de las proteínas en la preparación y las precipita. Puesto que el fenol y la solución salina amortiguadora no se mezclan, solo se requiere centrifugar la suspensión para separar las bases, permaneciendo el DNA (y el RNA) en la solución dentro de la fase acuosa de arriba y la proteína presente como un precipitado concentrado en la interfase. La fase acuosa se retira del tubo y sesomete a ciclos repetidos de agitación con fenol y centrifugación hasta agotar toda la proteína de la solución. Añadiendo etanol frío. El etanol frío forma una capa arriba de la solución acuosa del DNA, el cual, se enrolla sobre una varilla de vidrio conforme sale de la solución. En la interfase el RNA sale de la solución salina.
En contraste, el RNA sale de la solución como precipitados que seasienta en el fondo del vaso. Luego de este primer paso de purificación, se disuelve el DNA y se trata con ribonucleasa mediante tratamiento con una proteasa. Enseguida se quita la proteasa por desproteinización con fenol y se vuelve a precipitar el DNA.
La electroforesis es una de las técnicas mas empleada en bioquímica y biología molecular, usada para separar y a veces purificar macromoléculas,especialmente proteínas y ácidos nucleicos, que difieren en tamaño, carga o conformación. Cuando las moléculas cargadas son sometidas a un campo eléctrico, migran hacia el polo positivo (ánodo) como es el caso de los ácidos nucleicos o negativo (cátodo) de acuerdo a su cargas.
Los fragmentos de ADN lineal migran a través del gel de agarosa con una movilidad inversamente proporcional al log10 de sumasa molecular, situándose los más pequeños más cerca del polo positivo, adoptando una apariencia similar a un código de barras. Cada barra contiene un fragmento de ADN de un tamaño determinado más o menos cada 23 pares de bases. Entre los diferentes factores que afectan la movilidad de los fragmentos de ADN en el gel de agarosa que pueden optimizarse para la separación de los fragmentos está la...