Extracción de DNA genomico, amplificación por PCR del gen AMG y de un fragmento de DNA mitocondrial

INTRODUCCIÓN

Las células de todo ser humano contienen dos tipos de DNA; DNA nuclear y DNA mitocondrial.
El DNA nuclear se encuentra en el núcleo de las células en forma de cromosomas. Cada célula tiene un único DNA nuclear, mientras que en promedio tiene entre 500-1000 moléculas de DNA mitocondrial, cifra que varía dependiendo del tipo de célula.
El DNA mitocondrial es una cadena circularde ácido desoxirribonucleico que se encuentra dentro de un orgánulo de la célula llamado mitocondria que, entre otras funciones, es el encargado de producir la energía para la célula. Un ejemplo de la función de dichos orgánulos podría ser el de los espermatozoides. Ellos tienen mitocondrias en el flagelo o cola, pero no en la cabeza. Por lo tanto, en la fecundación, es sólo la cabeza delespermatozoide la que penetra en el óvulo, mientras que el flagelo se separa y cae. Por tanto, el embrión sólo recibe DNA mitocondrial de la madre, ya que los óvulos sí tienen mitocondrias. En consecuencia, el análisis del DNA mitocondrial se puede utilizar para verificar parentescos genéticos de dos personas, por “vía materna”.
El gen de la amelogenina, es un gen de copia única (homólogo) el cual estaubicados sobre los cromosomas sexuales XY en la ubicación:
Xp22.1-Xp22.3 e Yp11.2
La secuencia de este gen en el cromosoma Y se diferencia de la del X por una deleción de aproximadamente 200 pb. Esta característica, dos muestras de células epiteliales y una PCR, permiten distinguir si la persona es de sexo masculino o femenino. Utilizando un par adecuado de primers es posible amplificar el gen deambos cromosomas. Un análisis posterior por electroforesis en gel permitiría diferenciar el gen completo del cromosoma X y el deleccionado del Y de menor peso molecular.
Para las muestras femeninas se esperaría ver una única banda, posiblemente más intensa debido a que involucra el doble de concentración de DNA que en hombres, de aproximadamente 360 pb correspondiente al gen que se hallaba en elbrazo corto del cromosoma X. Para hombres esperaría verse dos bandas claramente diferenciadas, un de aproximadamente 360 pb correspondiente al gen en el cromosoma X y una de 160 pb presente en el cromosoma Y.
Las moléculas de DNA mitocondrial están constituidas en mayor parte por secuencias codificantes. Su herencia es exclusivamente materna y dado que no experimenta recombinación,independientemente del número de generaciones transcurridas, la única posibilidad de variación entre un ancestro femenino y su descendencia es por medio de mutaciones.
La frecuencia de mutaciones espontaneas es mayor que en el DNA nuclear, lo cual es producto de la combinación de diversos factores. En primer lugar la alta concentración de radicales libres y especies reactivas que se producen en el interiormitocondrial durante los procesos energéticos de síntesis de ATP. La sensibilidad de estos cromosomas se ve aumentada por la ausencia de Histonas que protejan al DNA. Una menor eficiencia de los mecanismos de reparación y de síntesis por el empleo de la DNA polimerasa Ƴ, con baja capacidad de corrección de errores durante la polimerización. Además la velocidad de síntesis es 100 a 200 veces más lentaque la nuclear, lo que permite que regiones de simple cadena permanezcan expuestas por más tiempo y puedan ser dañadas por las abundantes especies reactivas presentes. La región del Asa D muestra los niveles más altos de mutación debido a que allí se forma una estructura de triple cadena anclada a la membrana interna mitocondrial. La cadena no apareada exhibe una altísima sensibilidad a laagresión por radicales libres.
En nuestras células existe un estado de heteroplasmia debido a la aparición de mutaciones espontaneas en la secuencia mitocondrial. Por los métodos que existen solo se detecta el genoma mayoritario. Por lo tanto se observar una variación, ese cambio en la secuencia ocurrió varias generaciones previas a través de las cuales se fue incrementando su presencia hasta poder...