Extracción de dna a partir de células vegetales, pcr, extracción de plásmidos y electroforesis en gel de agarosa

SEDE MEDELLÍN
LABORATORIO DE FUNDAMENTOS EN CULTIVOS CELULARES

Extracción de DNA a partir de células vegetales, PCR, Extracción de plásmidos y Electroforesis en gel de agarosa
Laboratorio de Ingeniería Genética

 
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Resumen
Extraer el DNA puro de células vegetales de una hoja dela planta del banano, utilizando protocolo de extracción. Se realizó la PCR para amplificar este fragmento y posteriormente se realizó la electroforesis en gel de agarosa tanto para esta muestra amplificada como para la misma sin amplificar y para los plásmidos extraídos de E. coli DH5-α, con el fin de adquirir práctica en el manejo de la técnicas empleadas.

Palabras claves: Extracción deácidos nucléicos y plásmidos, PCR, Electroforesis, DNA
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1. Introducción

PRINCIPIO DE LA METODOLOGÍA

Para la realización de la extracción de DNA se necesitan de una serie de etapas básicas.
Como primera medida tiene que romperse la pared celular y la membrana plasmática para podertener acceso al núcleo de la célula, también debe romperse la membrana nuclear para dejar libre el DNA.
Con la sal se evita la unión de las proteínas al DNA y para lograr aislar el DNA hay que hacer que se precipite en alcohol, aunque el DNA es soluble en agua, cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el agua. Con el alcohol logramos separar el DNAde otros componentes celulares, los cuales se quedan suspendidos en la solución acuosa.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tiene como objetivo, a partir de un fragmento de DNA determinado obtener un gran número de copias partiendo de un mínimo, sirve para amplificar una molécula de DNA lo cual hace que sea más fácil identificar si la muestra está contaminada con virus o bacterias.En la electroforesis la mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas  en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir  cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo).         El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas adicionales; inicialmente la fricción con el solvente dificultará  este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado  las moléculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energía  cinética propia denominado  difusión.  La energía cinética de las moléculasaumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión. 
      La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea, de tal manera que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de solución, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo. 

2. Materiales y métodos

Para extracción de DNA:Los materiales empleados fueron:
- Micro pipetas
- Morteros
- Nitrógeno líquido
- Hoja de plátano
- Buffer CTAB
- Cloroformo
- Isopropanol
- Etanol 0.7
- Baño maría y centrífuga
-Tubos de eppendorf
- H2O ó TE

Para PCR:
-DNA blanco (bacteria)
-Primers (F,R)
-Buffer 10X
-dNTP’s-
-MgCl2
-Taq polimerasa
-H2O ultra pura
-Hielo
-Micro pipetas
-Puntas para micro pipetas-Tubos para PCR
-Termociclador
-Centrífuga

Para Electroforesis
-Agarosa
-Buffer TBE 0.5 x
-Bromuro de Etidio
-Horno microondas
-Micro pipetas, puntas
-Cámara de elctroforesis horizontal
-Peines
-Bandejas de papel
-Fuente de poder

Descripción del método

Inicialmente se procede a la preparación de la muestra, para esto se pulveriza la hoja de plátano mediante maceración en...