Extracción De Dna

EXTRACCIÓN DE DNA

Fernando Chaves
Leidy Arciniegas


1. Extracción de DNA.

Protocolo de extracción de ADN genómico a partir de 20-30 mg / 40-60 mg de cola de ratón:

• Lisis celular

1. Colocar 15 mm (20-30 mg) / 30 mm (40-60 mg) de cola de ratón troceada en 600 μl / 1.20 ml de Solución de Lisis.
2. Añadir 3 μl / 6.0 μ l de Proteinasa K. Mezclar e incubar a 55ºC durante toda lanoche, o hasta la lisis total.
Si es posible, invertir o agitar mediante vortex periódicamente durante la incubación.

• Tratamiento con RNasa

1. Enfriar la muestra a temperatura ambiente.
2. Añadir 3 μl / 6.0 μl de RNasa al lisado.
3. Mezclar la muestra por inversión del tubo e incubar a 37ºC durante 15-60 minutos.

• Precipitación de proteínas

1. Añadir 360 μl / 720 μl de Solución deprecipitación de proteínas.
2. Agitar mediante vortex vigorosamente durante 20-30 segundos.
3. Centrifugar a 14.000 xg / 2.500 xg durante 5 / 10 minutos. Se observará que el precipitado proteico forma un pellet.

• Precipitación del ADN

1. Pasar el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo de 1.5 ml que contenga 600 μl de isopropanol o a un tubo de 15 ml que contenga 1.2 ml de isopropanol.Mezclar por inversión varias veces.
2. Centrifugar a 14.000 x g / 2.500 xg durante 3 minutos.
3. Eliminar el sobrenadante. Añadir 600 μl / 1.2 ml de etanol 70% e invertir varias veces para lavar el pellet de ADN.
4. Centrifugar a 14.000 xg / 2.500 xg durante 2 minutos. Eliminar todo el etanol cuidadosamente pues el pellet de ADN puede desplazarse.
5. Invertir el tubo y dejar secar en papelabsorbente durante 15 minutos.

• Hidratación del ADN

1. Añadir 100-250 μl / 250-500 μl de Solución de Hidratación del ADN.
2. Incubar a 65ºC durante 1 hora con periódicas agitaciones para ayudar a la dispersión del ADN, o incubar “overnight” a temperatura ambiente para que se rehidrate.
3. Conservar a 2-8ºC. Para almacenajes largos conservar a –20ºC o –80ºC.



Protocolo de extracción deADN genómico a partir de 1 ml / 5 ml de cultivos de bacterias
Gram(-) y Gram(+):

Las bacterias Gram(+) son más difíciles de lisar es por ello que se recomienda la incubación con enzimas líticos.
Para ciertas especies de Staphylococcus una mezcla de Lisozima (10 mg/ ml) y lisostafina (10 mg / ml) es
necesaria.

• Lisis celular

1. Añadir 1.0 ml / 5.0 ml de un cultivo overnight a un tubode 1.5 ml / 15 ml
2. Centrifugar a 14.000 xg / 2.500 xg durante 30 segundos / 3 minutos. Eliminar el sobrenadante. Para
bacterias Gram (+) continuar con el punto 3. Para bacterias Gram (-) pasar directamente al punto 6.
3. Resuspender las células en 540 μl / 2.7 ml de EDTA 50 mM.
4. Añadir la cantidad de enzimas líticos apropiada, 60 μl / 300 μl de Lisozima (10 mg/ml). El propósito de estetratamiento es debilitar la pared celular para hacer más eficiente la lisis celular.
5. Incubar la muestra a 37ºC durante 60 minutos. Centrifugar a 14.000 xg / 2.500 xg durante 2 minutos / 5
minutos. Eliminar el sobrenadante.
6. Añadir 600 μl / 3.0 ml de Solución de Lisis al pellet celular y pipetear para resuspender y lisar las células. Incubar las muestras a 80ºC durante 5 minutos. Enfriar atemperatura ambiente.

• Tratamiento con RNasa
1. Añadir 3 μl / 15 μl de RNasa al lisado.
2. Mezclar la muestra por inversión del tubo e incubar a 37ºC durante 15-60 minutos.

• Precipitación de proteínas

1. Enfriar la muestra a temperatura ambiente.
2. Añadir 300 μl / 1500 μl de Solución de precipitación de proteínas.
3. Agitar mediante vortex vigorosamente durante 20-30 segundos.
4.Centrifugar a 14.000 xg / 2.500 xg durante 5 / 10 minutos. Se observará que el precipitado proteico forma un pellet.

• Precipitación del ADN

1. Pasar el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo de 1.5 ml que contenga 600 μl de isopropanol o a un tubo de 15 ml que contenga 3 ml de isopropanol. Mezclar por inversión varias veces.
2. Centrifugar a 14.000 xg / 2.500 xg durante 3 minutos.
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