Fagos Reporteros

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Andrea Cuentas Condori

I. Introducción

Un bacteriófago (fago) es un virus que infecta específicamente a bacterias, introduce su material genético y es capaz de transmitir información genética por recombinación. Esta información puede ser previamente manipulada en laboratorio y, por ende, la información que se termine expresando en la bacteria dependerá de lainformación que el virus contenga. Con esta premisa, técnicas moleculares han permitido le inserción de un gen reportero en el DNA del virus. Un gen reportero es un segmento de ADN que codifica para una proteína que es fácilmente cuantificable (es decir, una proteína fluorescente o una enzima).
En este método, un bacteriófago es modificado para transportar un gen reportero. El gen reportero se introduce enuna bacteria de destino a través del bacteriófago durante su ciclo de infección normal. Así, una vez que el gen reportero ha sido introducido en la bacteria, se expresa (es decir, se produce la proteína), permitiendo así que las células bacterianas sean rápidamente identificadas.
Este método puede ser usado para detectar la presencia de bacterias patogénicas presentes en alimentos medianteluciferasas bacterianas y eucariotas, la proteína de hielo nucleación, y los genes β-galactosidasade E. colireportero. Pero además, permite el diagnóstico rápido y sensible de infecciones como la tuberculosis.
En esta actividad se ensayará la capacidad de reportero que tiene el fago 129 sobre la cepa MC2155 de M. smegmatis al causar la lisis celular.

II. Materiales y Métodos

Para elcrecimiento de las bacterias se inoculó 10ml de 7H9 broth-0.05% Tween-80 con M. smegmatis y luego se lavó el pellet dos veces con caldo 7H9 sin Tween-80 centrifugando a 3000g a temperatura ambiente.
Luego se preparó diluciones seriadas de 1:10 del fago D29 en 0.5mL de buffer MP generando diluciones desde 10-1 hasta 10-4. Se agregó 500uL del cultivo de M.smegmatis sin Tween-80 a cada dilución de fago.Se incubó la mezcla de fago-M. smegmatis a 37°C por 30min. Se tomó 300ul de fago-M.smegmatis y se agregó a 5mL de top agar licuado (56°C), se mezcló bien y se puso en placas con base agar. Se esparció el top agar moviendo la placa en forma de círculos. Se dejó que el top agar solidifique y se incubó las placas a 37°C por 2 días. Se contó los halos en cada dilución de aquellas placas con halosdefinidos.


Tabla 2. Control negativo |
1 | 0 pfu |
2 | 0 pfu |
3 | 0 ufc |
III. Resultados
Tabla 1. Resultado del número de pfu/mL |
GrupoDilución | 1 | 2 | 3 | 5 | 6 | 7 |
10-1 | I | I | I | I | I | 347 |
10-2 | 10 | 81 | 133 | 108 | 115 | 106 |
10-3 | 15 | 26 | 5 | 18 | 15 | - |
10-4 | 3 | 7 | 0 | 0 | 0 | 0 |
PROMEDIO | 4.924 | 1.145 | 1.934 | 3.044 | 2.84 |1.124 |

La tabla 1 muestra el número de pfu (placas o halos presentes) que se registr’o a las 48 horas de cultivar la muestra, esto según dilución y grupo de trabajo. Es posible observar que a medida que la dilución es mayor, el número de pfu disminuye. Además, también se muestra el promedio de pfu obtenidos por cada grupo. La tabla 2, por su lado, muestra los ensayos control realizados. Caberesaltar que la tercera placa del grupo control no presenta pfu, pero tampoco presenta alguna ufc, es decir, ninguna bacteria fue agregado al medio. Si solo se incluyó bacteriófago, no es posible apreciar eso en la placa pues en el medio de cultivo no hay célula donde el bacteriófago pueda reproducirse. En las otras placas control sí se observan unidades formadoras de colonias (ufc).

IV.Discusión

Actualmente, el diagnóstico estándar para la detección de Mycobacterium tuberculosis sigue siendo la visión microscópica de bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) y el cultivo en medio Löwenstein-Jensen. Sin embargo, a pesar de requerir un bajo presupuesto,ésta técnica carece de especificidad y tiene una sensibilidad máxima de 80%, además de demandar de mínimo 3 o 4 semanas para dar...