FARMACIA

INTRODUCCIÓN
En los últimos años, el diagnóstico clínico ha experimentado profundas modificaciones debidas, en gran medida, a los avances producidos por los nuevos métodos cuantitativos de análisis celular.
De entre ellos destaca la citometría de flujo, que ha alcanzado gran relevancia, además de la que ya tenía en la investigación básica.
La citometría constituye un complemento valioso delas técnicas clásicas utilizadas para el estudio de la morfología, biología y bioquímica celular.
Aunque, desde el punto de vista cronológico, la citometría de flujo es una tecnología relativamente reciente, sus características especiales como técnica de análisis celular han hecho que en la última década su uso se haya extendido de forma rápida, desde los laboratorios de investigación básica hastalos laboratorios clínicos.
La citometría de flujo ha encontrado amplia utilidad en ciencias como la inmunología, hematología, oncología, anatomía patológica y biología celular. La conjugación de marcadores fluorescentes con anticuerpos monoclonales o policlonales ha hecho posible los estudios de la densidad y la distribución de determinantes y receptores de la superficie y del citoplasma celular,permitiendo identificar subpoblaciones celulares.
Por otra parte, en comparación con los métodos bioquímicos de análisis celular, en los que se obtiene un resultado promedio para toda la muestra, la citometría de flujo es capaz de proporcionar una información cuantitativa sobre cada célula en particular y permite identificar en una muestra subpoblaciones de células diferentes, incluso cuandoestán escasamente representadas.(1)
¿Qué es la citometría de flujo?
La citometría de flujo es una técnica que permite el análisis rápido de la morfología de las células en un medio líquido. Se basa en la reflexión/refracción de un delgado rayo láser que incide sobre cada célula según va pasando. La citofluorometria analiza, además, la presencia/ausencia de proteínas celulares para las que existe unanticuerpo, o parámetros bioquímicos para los que exista un fluoróforo adecuado. Se basa en la capacidad de los compuestos fluorescentes (también llamados fluoróforos) de excitarse al absorber luz de una determinad longitud de onda, llamada longitud de onda de excitación, y emitir luz a una longitud de onda superior (longitud de onda de emisión).(2)
La utilización de fluorocromos se basa en laparticularidad de ciertas moléculas para emitir luz a una longitud de luz determinada cuando son excitadas por un haz de luz con menor longitud de onda. Estas propiedades se encuentran en moléculas como la fluoresceína (FITC) o la ficoeritrina (PE), u otros compuestos de nueva generación como pueden ser los Alexa-fluor.
Habitualmente estas moléculas se emplean unidas covalentemente a anticuerpos,estreptavidina o cualquier otra que reconozca específicamente la característica que tengamos la intención de analizar (una proteína, un lípido, etc). Además, la adecuada combinación de los fluorocromos y la detección de moléculas en las células permiten el análisis de varios parámetros de forma simultánea.
Cuando las células o partículas a analizar atraviesan el punto de detección, la luz de laseres dispersada por la propia célula detectándose tanto la dispersión frontal (“Forward Scatter” o FSC), que nos da una idea del volumen; como la dispersión lateral (“Side Scatter” o SSC), que nos informa de la complejidad. La representación gráfica de estos dos parámetros permite diferenciar las poblaciones a analizar y, en todo caso, permite descartar la información procedente de restoscelulares, agregados del medio extracelular o células apoptóticas que puedan alterar el análisis. Si la intención es la de detectar una determinada molécula en particular, solo se necesita utilizar un anticuerpo marcado con un fluorocromo. El citómetro detecta la emisión de luz del fluorocromo, cuando este es activado con la luz del láser; esta señal de emisión es filtrada, amplificada y detectada a...