Fermantacion

CULTIVO DE CÉLULAS BHK21 CLON 13 EN SUSPENSIÓN:
CONSTRUCCIÓN Y OPERACIÓN DE UN FERMENTADOR EXPERIMENTAL
J. Obregón*, P. Ramos*, J. Aponte* y N. Conde*
* FONAIAP. Centro Nacional de Investigaciones Veterinarias
Apdo. 70. Maracay, Venezuela
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RESUMEN
En el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Celulares del Instituto de Investigaciones Veterinarias(CENIAP-FONAIAP), se utiliza la línea celular BHK 21 clon 13, adaptada a cultivos en suspensión para la multiplicación del virus de la fiebre aftosa, la cual se utiliza como antígeno en la producción de vacuna antiaftosa inactivada. Con el propósito de aumentar la producción celular, se construyó un fermentador sencillo experimental de 12 litros, con aireación al cultivo, lo cual permite el máximoaprovechamiento del volumen de cultivo disponible y la optimización del desarrollo de la población celular. Partiendo de una densidad celular inicial promedio de 7 x 105 cel/ml (D.S.: ± 0,20 x 105) se alcanza una densidad celular final de 1,81 x 106 cel/ml (D.S.: ± 0,79 x 105), en un lapso de tiempo de 22,9 horas (D.S.: ± 2,5), lo que significa un índice de multiplicación de 2,5 (D.S.:± 0,67) y unaproducción total de 1,05 x 1010 células por cultivo. En este trabajo se describe la técnica empleada para aumentar la producción celular.
INTRODUCCIÓN
El creciente interés dedicado a los campos de investigación viral y producción de vacuna, ha traído como consecuencia la necesidad de incrementar la producción del cultivo masivo de células eucarióticas.
En muchos laboratorios se utiliza lalínea celular BHK 21 clon 13, adaptada a cultivos en suspensión para la replicación del virus de la fiebre aftosa (2,6), la cual se aprovecha como antígeno para la producción de vacuna.
En el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Celulares, del Instituto de Investigaciones Veterinarias (CENIAP-FONAIAP) se utiliza un método de cultivo mixto (monocapa-suspensión-monocapa), tripsinizando monocapasadaptadas para desarrollar cultivos en suspensión y finalmente sembrarlos en frascos rotatorios para obtener monocapas susceptibles al virus de la fiebre aftosa (7). En la etapa de cultivo en suspensión convencional se usan botellas Pyrex de 8 litros, aprovechando sólo el 30% (2,5 litros aproximadamente) de su volumen, debido a que la población celular utiliza para su respiración únicamente el airepresente en el envase.
Se podría considerar el vaso de cultivo como un sistema de diálisis en el cual un nutrimento (oxígeno) se difunde a través de la interfase gas-líquido y se disuelve en el cultivo. Existe una relación entre la máxima tasa de crecimiento y la máxima tasa de solución de oxígeno en el cultivo, éste incrementará su población hasta el punto en que el sistema suministre oxígeno a sumáxima capacidad; desde este momento, el incremento celular tenderá a ser lineal (1) y el oxígeno se habrá convertido en el nutrimento limitante.
Al respecto, Deschaux et al. (4) estudiaron el metabolismo respiratorio de las células BHK Clon 13, señalando que su actividad respiratoria es más intensa, precoz y durable que en cultivos en monocapa.
Con el propósito de obviar esta limitante, serealizaron varias experiencias aireando cultivos de BHK 21 Clon 13 en suspensión, que condujeron al diseño de un aparato fermentador cuya construcción y técnica de operación se describen en el presente trabajo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales
Frasco aspirador Schott de 15 litros 4203/NS 60
Frasco Pyrex de 8 litros
Matraces Erlenmeyer de 3 litros
Tapones de goma N° 12 y N° 13
Barrasmagnéticas agitadoras cubiertas de Teflón de 6 cm x 6 mm
Mesa agitadora y/o agitadores magnéticos
Portafiltros para gases Millipore Cat. N° 43 047 00
Filtros de membrana de 0,22µ Millipore Cat. N° 65 047 00
Bomba de aire regulable para acuario
Termómetro
Hematocritómetro (Cámara de Neubauer)
Algodón de fibra de vidrio
Cemento epóxico (E-Pox-E. DURO)
Grasa de siliconas
Tubos de...