fermentacion






Laboratorio N°2: fermentación de levadura y cuantificación del consumo de glucosa.





Alumna: Cinthya Álvarez
Asignatura: Biotecnología en alimentos





Introducción
Las levaduras son cualquier tipo de hongos microscópicos unicelulares, los cuales son importantes por su capacidad de realizarla descomposición mediante la fermentación de diversos cuerpos orgánicos, principalmente los azucares o hidratos de carbono, finalizando con la producción de distintas sustancias.
La levadura más conocida y utilizada en laboratorio es la Saccharomyces cerevisiae, la cual crece en forma anaeróbica, y que realiza fermentación alcohólica, por lo cual se utiliza a nivel industrial, por ejemplo en laproducción de cerveza, vino, pan, etc.
Por otro lado la fermentación de levadura es conocida como la respiración anaeróbica, la cual ocurre cuando la célula respira en un ambiente con falta de oxígeno, en donde el producto producido por esta llamado alcohol etílico.
En cuanto al nivel de glucosa podemos decir que este según su disponibilidad afecta directamente al tiempo de la fermentación, esdecir, si hay mayor nivel de glucosa, más lenta será la fermentación. Así mismo la demora en la fermentación también se relaciona con la presión osmótica que existe en las paredes de las células creadas por los altos niveles de glucosa.
Finalmente el tiempo de la fermentación es controlado para que el resultado del proceso sea óptimo, lo cual se mide generalmente en el uso de la repostería y enla elaboración de bebidas alcohólicas.
En este laboratorio ocuparemos la levadura Pichia pastoris para que realice la fermentación y medir el consumo de glucosa.




Objetivo general
Aprender como la levadura realiza la fermentación para producir etanol
Objetivos específicos:
Construir una curva de calibrado de biomasa-absorbancia.
Construir una curva de calibrado deglucosa-absorbancia.
Determinar una cinética de biomasa.
Determinar una cinética de consumo de glucosa.
Materiales y métodos
Equipos:
Shaker.
Centrifuga.
Placa calefactora.
Instrumentos:
Espectrofotómetro.
Otros materiales:
Vaso precipitado
Pipetas de 5 y 10mL
Tubos de ensayos estériles y no estériles.
Capachos para centrifuga.
Gradilla
Celdas para espectrofotómetro.
Papel aluminio.Desecadora.
Frasco color ámbar.
Micropipetas y puntas.
Reactivos:
Medio YPD
Glucosa
Tartrato de sodio y potasio
NaOH y ácido dinitrosalicílico.
Métodos:
a) Preparación de medios e inoculación de S. cerevisiae
Preparación medio YPD
Extracto levadura
10
(g)
Peptona
20
(g)
H2O destilada
900
(ml)
20% dextrosa
100
(ml)
Volumen total
1
(l)
Note: autoclavar 20% dextrosa separadadel resto

Preparación del reactivo DNS
Para preparar 20 ml de reactivo DNS:
-Adicionar 0,32 g de NaOH a aproximadamente 9,6 ml de agua destilada y solubilizar bajo agitación.
-Disolver en esta mezcla 6 g de tartrato de sodio y potasio, bajo agitación.
-Calentar y agregar lentamente 0,2 g de ácido dinitrosalicílico.
-Enfriar y aforar a 20 ml con agua destilada.
-Guardar en refrigeradoren frasco color ámbar.
Inocular con S. cerevisiae, crecida ON, diferentes matraces estériles con medio e ir cuantificando la biomasa y consumo de azucares a lo largo del tiempo.
b) Peso seco de cada dilución
Sacar una muestra del cultivo y diluirla convenientemente para tener 5 diluciones. La suspensión más concentrada debe medir una absorbancia de 0,6. Medir la absorbancia de cada una a 600 nmcontra un blanco de agua destilada. A cada muestra diluida centrifugar un volumen exacto (10 a 15 ml) por 15 minutos a 15000 rpm, retirar el sobrenadante y resuspender con agua destilada, repetir el procedimiento dos veces más. La última vez retirar el sobrenadante y llevar a estufa de secado (90-95 °C), en un capacho de aluminio previamente secado y pesado. Se debe mantener en la estufa por 12...