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REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA BQGOTA (COLOMBIA), VOLUMEN 23, No, 2 DE 1994

EXTRACCIÓN DE ADN PLASMIDICO
DE CEPAS DE Rhizobium leguminosarum
EN DIFERENTES FASES DE CRECIMIENTO
M, Y. Cortés L, F. J. Vargas P. J. E. Pinilla C, G. Pérez G. y Y. N. de
Navarro*.
*Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de
Colombia, A.A. 14490 Santafé de Bogotá, Colombia.
Keywords:Rhizobium leguminosarum, plasmid, DNA.

RESUMEN
S.e realizó una comparación simultánea de cuatro métodos para la extracción de ADN plasmídico. De los resultados experimentales se concluyó que
únicamente con la técnica de Kronstad, en las condiciones ensayadas y con
cultivos de cepas de Rhizobium leguminosarum bv Viceae en fase de
crecimiento logarítmica temprana, se visualizaron 3 plásmidospara la cepa
SEMIA 335 y un plásmido para la cepa B.

ABSTRACT
Four methods for extracting plasmid DNA were compared. The Kronstad
technique under the assayed experimental conditions was the only one that
allowed the obtention of plasmids. DNA was isoiated from two strains of
Rhizobium leguminosarum bv viceae when the strains were grown to early
logaritmic phase. The strain SEMIA 335yielded three plasmids and strain
B yielded one plasmid.

INTRODUCCIÓN
La mayoría de las técnicas reportadas para efectuar la lisis celular de
Rhizobium, aconsejan un crecimiento bacteriano en fase estacionaria temprana, con un valor de densidad óptica a 540 nm. de aproximadamente 0.8 1.0 (1,2,3,4,5,). En esta fase los cultivos de Rhizobium se observan densos
y de apariencia gomosa, debido a queestas bacterias son productoras de
gran cantidad de lipopolisacáridos (LPS), fibrillas de celulosa, polisacáridos

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capsulares neutros (CPS), B-1.2 glucanos cíclicos y polisacáridos
extracelulares aniónicos de alto peso molecular (EPS). Esos polisacáridos
pueden encontrarse en la pared celular, o sersecretados en el medio (6) y
como lo anotan Ohno y Morrison (7) dificultan la lisis celular e interfieren
en el aislamiento del ADN plasmídico.
En diferentes cepas de Rhizobium se han detectado plásmidos de gran tamaño
(Megaplásmidos) con pesos moleculares que oscilan entre 90 y 300 MDa. (8).
Por la presencia de megaplásmidos en la mayoría de los Rhizobium, su
susceptibilidad al ataque por DNAsas ysu sensibilidad a la ruptura mecánica, se debe seleccionar una metodología de extracción que garantice la
conservación de los mismos.
Cada una de las metodologías empleadas tiene diferentes fundamentos. Para
la lisis celular se emplean detergentes iónicos como el Sarkosyl y el SDS,
seguido de tratamientos a pH básico (9,10,11,12). También se han empleado
tratamientos enzimáticos con RNAsa(13), Pronasa (1), Lisozima-Pronasa
(4).
Una vez lisada la bacteria el ADN cromosómico y plasmídico, se llevan a un
pH alcalino (mayor de 12) y luego de un tiempo, el pH se lleva a 8.5-9.0 de
manera que el ADN plasmídico se renaturalice. El ADN que permanece
soluble (plasmídico principalmente) es luego precipitado selectivamente
con polietilenglicol (PEG) 6000-8000.
Cuando en nuestrolaboratorio se ensayaron estas condiciones de extracción
del ADN plasmídico a partir de cultivos en fase estacionaria, obtuvimos
resultados infructuosos; por esta razón en este trabajo se estudió la incidencia de la fase de crecimiento bacterial en la extracción y detección de
plásmidos. Para ello se realizó la lisis en etapas de crecimiento comprendidas entre la fase logarítmica temprana hasta la faseestacionaria tardía
(turbidez (T) a 540 nm = 0.2-0.9).
Para la extracción del ADN plasmídico se ensayaron las siguientes técnicas:
Hirsch et al (1), Meade et al (4), Kronstad et al (11) y Maniatis et al (12); de las
cuales la técnica de Kronstad et al (II) nos permitió la mejor extracción y
visualización de los plásmidos. Además la técnica seleccionada es sencilla,
poco costosa y utilizada...