Flebotomia
Páginas: 9 (2237 palabras)
Publicado: 13 de mayo de 2014
TRABAJO PRÁCTICO Nº 7: AISLAMIENTO DE ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO
Objetivos:
-Aislar el complejo desoxirribonucleoproteico (ADN-proteína) a partir de timo de ternera
-Disociar el complejo en sus dos componentes: DNA y proteínas
-Precipitar desoxirribonucleato de sodio.
-Disolver desoxirribonucleato de sodio obtenido.
Introducción
ELECCION DEL TEJIDO
Con el objeto deelegir tejido biológico adecuado para la obtención del ADN, se deben considerar algunos requisitos, entre los que se puede mencionar los siguientes:
1) Elevada concentración de ADN.
2) Mínima relación ARN/ADN
3) Baja actividad de ADNasa.
4) Elevado contenido ADN/órgano.
5) Fácil disponibilidad.
6) Bajo costo.
1) Elevada concentración de ADN.
Casi todas las células contienen ADN;excepcionalmente, algunas de ellas carecen de núcleo y también de ADN, como en el caso de los glóbulos rojos de los mamíferos.
En las células nucleadas, la cantidad de ADN varía notablemente en los diferentes tejidos. Como ejemplo, consideremos el contenido de ADN de los diferentes tejidos de una rata adulta:
En esta tabla se observa que, en la rata adulta elórgano más rico en ADN es el timo (concentraciones algo menores se encuentran en la médula ósea, el bazo y el intestino delgado.).
2) Mínima relación ARN/ADN:
La presencia de elevadas concentraciones de ARN dificulta el aislamiento del ADN por tratarse de compuestos estrechamente relacionados desde el punto de vista químico.
En general las células vivas contienen una cantidad de ARNconsiderablemente mayor que la de ADN. Un caso extremo lo constituye el ovocito de los anfibios en el que la relación ARN/ADN es 31,76; en el extremo opuesto podemos ubicar a las células espermáticas que están casi exclusivamente constituidas por ADN. En la siguiente tabla vemos como varía esta relación en los diferentes tejidos de la rata adulta:
TEJIDO
ARN/ADN
hígado
3,68
glándula sub-maxilar
1,73riñón
1,08
bazo
0,335
tejido linfoide
0,285
timo
0,195
Bajo este aspecto, también el timo se encuentra en las mejores condiciones.
3) Baja actividad de ADNasa
Los extractos de distintos tejidos como el hígado, bazo y timo tienen la propiedad de licuar los geles de ADN debido a la presencia de la desoxirribonucleasa, enzima que interviene específicamente en la degradación delADN; la ADNasa es una fosfodiestearasa altamente específica. Para su acción esta enzima requiere la presencia de cationes bivalentes; los activadores más específicos son los iones magnesio, manganeso, hierro y cobalto; todos ellos son muy parecidos con respecto a la intensidad de la acción que producen.
Los inconvenientes derivados de la presencia de desoxirribonucleasa en los tejidos puedeevitarse mediante el empleo de inhibidores de esta enzima. Entre ellos se encuentran las sustancias que extraen los cationes como los aniones citrato y fluoruro, los agentes quelantes como el EDTA (etilen diamino tetraacetato) los iones cobre y arseniato, fuertemente inhibidores a una concentración de 0,001 M y el borato a 0,02 M.
4) Elevado contenido en ADN/órgano.
Es muy importante que laconcentración del ADN en el tejido sea elevada; pero desde el punto de vista práctico, el material biológico será más ventajoso si la cantidad total del ADN en el órgano es también alta. Daremos un ejemplo:
Por lo que se ha visto hasta ahora, el timo es el órgano de la rata que reúne las mejores condiciones para la obtención de ADN; pero éste es un órgano pequeño: pesa aproximadamente 33 mg,por lo tanto se obtiene menos de 1 mg de ADN. En el timo de ternera la concentración del ADN es aproximadamente la misma (2250 µg ADN/100 mg de tejido), pero tiene un tamaño mucho mayor: pesa aproximadamente 500 g y se pueden obtener de él más de 100 mg de ADN, cantidad para la cual se deberían sacrificar unas 100 ratas adultas.
5) Fácil disponibilidad:
No basta con que el material...
Objetivos:
-Aislar el complejo desoxirribonucleoproteico (ADN-proteína) a partir de timo de ternera
-Disociar el complejo en sus dos componentes: DNA y proteínas
-Precipitar desoxirribonucleato de sodio.
-Disolver desoxirribonucleato de sodio obtenido.
Introducción
ELECCION DEL TEJIDO
Con el objeto deelegir tejido biológico adecuado para la obtención del ADN, se deben considerar algunos requisitos, entre los que se puede mencionar los siguientes:
1) Elevada concentración de ADN.
2) Mínima relación ARN/ADN
3) Baja actividad de ADNasa.
4) Elevado contenido ADN/órgano.
5) Fácil disponibilidad.
6) Bajo costo.
1) Elevada concentración de ADN.
Casi todas las células contienen ADN;excepcionalmente, algunas de ellas carecen de núcleo y también de ADN, como en el caso de los glóbulos rojos de los mamíferos.
En las células nucleadas, la cantidad de ADN varía notablemente en los diferentes tejidos. Como ejemplo, consideremos el contenido de ADN de los diferentes tejidos de una rata adulta:
En esta tabla se observa que, en la rata adulta elórgano más rico en ADN es el timo (concentraciones algo menores se encuentran en la médula ósea, el bazo y el intestino delgado.).
2) Mínima relación ARN/ADN:
La presencia de elevadas concentraciones de ARN dificulta el aislamiento del ADN por tratarse de compuestos estrechamente relacionados desde el punto de vista químico.
En general las células vivas contienen una cantidad de ARNconsiderablemente mayor que la de ADN. Un caso extremo lo constituye el ovocito de los anfibios en el que la relación ARN/ADN es 31,76; en el extremo opuesto podemos ubicar a las células espermáticas que están casi exclusivamente constituidas por ADN. En la siguiente tabla vemos como varía esta relación en los diferentes tejidos de la rata adulta:
TEJIDO
ARN/ADN
hígado
3,68
glándula sub-maxilar
1,73riñón
1,08
bazo
0,335
tejido linfoide
0,285
timo
0,195
Bajo este aspecto, también el timo se encuentra en las mejores condiciones.
3) Baja actividad de ADNasa
Los extractos de distintos tejidos como el hígado, bazo y timo tienen la propiedad de licuar los geles de ADN debido a la presencia de la desoxirribonucleasa, enzima que interviene específicamente en la degradación delADN; la ADNasa es una fosfodiestearasa altamente específica. Para su acción esta enzima requiere la presencia de cationes bivalentes; los activadores más específicos son los iones magnesio, manganeso, hierro y cobalto; todos ellos son muy parecidos con respecto a la intensidad de la acción que producen.
Los inconvenientes derivados de la presencia de desoxirribonucleasa en los tejidos puedeevitarse mediante el empleo de inhibidores de esta enzima. Entre ellos se encuentran las sustancias que extraen los cationes como los aniones citrato y fluoruro, los agentes quelantes como el EDTA (etilen diamino tetraacetato) los iones cobre y arseniato, fuertemente inhibidores a una concentración de 0,001 M y el borato a 0,02 M.
4) Elevado contenido en ADN/órgano.
Es muy importante que laconcentración del ADN en el tejido sea elevada; pero desde el punto de vista práctico, el material biológico será más ventajoso si la cantidad total del ADN en el órgano es también alta. Daremos un ejemplo:
Por lo que se ha visto hasta ahora, el timo es el órgano de la rata que reúne las mejores condiciones para la obtención de ADN; pero éste es un órgano pequeño: pesa aproximadamente 33 mg,por lo tanto se obtiene menos de 1 mg de ADN. En el timo de ternera la concentración del ADN es aproximadamente la misma (2250 µg ADN/100 mg de tejido), pero tiene un tamaño mucho mayor: pesa aproximadamente 500 g y se pueden obtener de él más de 100 mg de ADN, cantidad para la cual se deberían sacrificar unas 100 ratas adultas.
5) Fácil disponibilidad:
No basta con que el material...
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