Fosfatasa ácida en germen de trigo

Laboratorio N° 2: Determinación de actividad enzimática de la fosfatasa ácida en germen de trigo.

- 8 de Mayo de 2009 –

Introducción

Las enzimas son catalizadores orgánicos que disminuyen la energía de activación de las reacciones metabólicas, por lo que aumentan la velocidad, y permiten que se produzcan a temperaturas y presiones a las que normalmente no tendrían lugar (fig.1).Las fosfatasas catalizan la hidrólisis de ésteres y anhídridos de H3PO4, son responsables de la mineralización del fósforo orgánico del suelo y de la liberación del fósforo inorgánico necesario para los microorganismos y las plantas.
Se clasifican en fosfatasas ácidas (E.C. 3.1.3.2), y alcalinas (E.C. 3.1.3.1), las ácidas son producidas por microorganismos y plantas superiores (como el germen detrigo), mientras que las alcalinas son producidas principalmente por microorganismos.

En una curva de saturación de una reacción enzimática, al inicio, la velocidad permanece constante denominándose velocidad inicial (Vo), la cual va disminuyendo hasta llegar a un plateau que da a conocer una saturación de la enzima por el sustrato (fig. 2).

Al realizar un ensayo enzimático se debeelegir el mejor método, el más adecuado para lo que se quiere obtener, por lo que se debe tener en cuenta el ensayo de tiempo fijo y el cinético. En el primero, se detiene la reacción en un tiempo determinado y se calcula la concentración de sustrato consumido o de producto formado. Y en el ensayo cinético, se toma una serie de tiempos continuos muy próximos entre sí y se miden las concentraciones desustrato o producto.

En el siguiente práctico se realizó una curva de calibración para la formación de p-nitrofenol y se determinará la actividad de la fosfatasa ácida de germen de trigo mediante el sustrato artificial p-nitrofenil fosfato. Se cuantifica este sustrato liberado fotométricamente según el grado de hidrólisis. Se trabajará en una solución básica donde la longitud de ondade absorción corresponde a 405 nm.

Resultados

Experiencia A

|N° Tubo |Ml |ml NaOH (0.02M) |Absorbancia (405 nm) |µMolar |
| |p-nitrofenil(50µM) | | | |
|1 |0 |6 |0|0 |
|2 |1 |5 |0.166 |10 |
|3 |2 |4 |0.327 |20 |
|4 |3 |3 |0.487 |30 |
|5 |4|2 |0.640 |40 |
|6 |5 |1 |0.799 |50 |

Curva de calibración para la formación de p-nitrofenol.

|[p-nitrofenol] (µM) |Absorbancia (nm) |
|0 |0|
|10 |0.166 |
|20 |0.327 |
|30 |0.487 |
|40 |0.640 |
|50 |0.799 |

[pic]
(Fig.1)

Pendiente = ε
Por lo tanto ε =0.0159 L / µmoles cm

Experiencia B

Determinación de la actividad de la fosfatasa ácida de Germen de trigo.

Cada tubo contenía:
• 2mL de citrato 0.1M
• 2mL de NPP
• 1mL de enzima
• y fueron incubados a 37°C.

|N° Tubo |Tiempo de reacción (min) |A (405nm) |µmoles Pi |Velocidad (µmoles/min) |
|1 |0...