fosfatasa acida de germen


PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
BárbaraBezares, DanielaCampos, MatíasPozo y ClaudiaVidal

Resumen
En la búsqueda de nuevas funciones y/o propiedades de interés, requeridas para desarrollar productos y nuevas tecnologías en el área biotecnológica, las proteínas son las biomolecular indicadas, estas por su gran diversidad funcional y estructural son la fuente …...


IntroducciónEn biotecnología y en la mayoría de las ciencias biológicas y químicas las proteínas son las macromoléculas que han sido estudiadas con mayor énfasis (además de las ácidos nucleídos) durante estos últimos años, esto debido a la presencia de múltiples funciones y propiedades existentes en la gran gama y diversidad proteica, dichas propiedades van desde la regulación de los procesos celulares,transporte molecular en el medio celular, renovación de tejidos, etc.

Antes de realizar cualquier análisis en la actividad y/o determinación de alguna función a cierta proteína, es necesario obtenerla como una especie pura. Los métodos utilizados en la purificación de proteínas se basan básicamente en las características intrínsecas que varían de una proteína a otra, tales como su tamaño,carga o propiedades de unión. En este sentido la separación que se lleva a cabo a partir de un extracto, en donde se halla la proteína de interés, se denomina fraccionamiento.

Existen variados métodos cromatográficos utilizados normalmente para purificar
proteínas, en este primera etapa se utilizará una cromatografía de exclusión molecular, la cual consiste enla utilizaciónde ungel, denominado fase estacionaria, el cual se halla dentro de una columna. Luego la muestra que contiene las proteínas a purificar, eluyó por esta columna mediante la utilización de una fase móvil o eluyente, que puede ser agua destilada u otro. La porosidad de la fase estacionaria permite obtener diferentes velocidades de elución para cada molécula, eluyendo primero aquellas moléculas de mayormasa molecular y finalmente las de menor masamolecular. Así dicho método se fundamenta en la separación por diferenciación en el peso molecular de las proteínas presentes en la mezcla a travez,Switzer Robert (1999) afirma: “La cromatografía de filtración en gel también puede separar moléculas que son sólo diferencialmente excluidos en los poros de la matriz” (p. 28).

Los perfiles de elución deproteínas obtenidos a partir de la realización de la cromatografía se determinan gracias a la propiedad que poseen las proteínas de absorber la luz a longitudes de onda características, esto es debido a la presencia de aminoácidos de tirosina y triptófano en la cadena polipeptídica. La medición de la absorción de la luz se lleva a cabo mediante el uso de un espectrofotómetro para detectar eidentificar moléculas, para medir posteriormente su concentración. Este método consiste en incidir un rayo de luz a la muestra, la muestra absorbe una cantidad de luz y el resto pasa a través de un detector que traduce la señal transmitida en un número cuantificable. La relación existente entre la absorbancia de la muestra y la trasmisión de luz no absorbida está presente en la ley de Lambert-Beer:(1)

En donde Ii es la intensidad de la luz incidente, If es la intensidad de luz transmitida, ε es el coeficiente de extinción molar [L/mol cm], c es la concentración de la especie absorbente [moles/L] y l es el camino óptico de la muestra que absorbe la luz [cm].
Esta ley predice que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración de proteínas cuando el camino óptico esconstante, presentando un rango de linealidad en el intervalo de absorbancias de 0≤ A ≤ 1.

Se desea como objetivo en esta primera fase separar una mezcla de dos proteínas; Albúmina Sérica de Bovino (BSA)
66.382 Da (1) [2 mg/mL] y Fosfatasa Ácida de germen de trigo 50.000 – 60.000 Da aprox. (2)[6 mg/mL], y con fase estacionaria Sephadex G-100, con rango de fraccionamiento de 4.000 a 150.000...