Fosfatasa Acida

UNIVERSIDAD DEL VALLE FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS Departamento de Química Bioquímica ENZIMOLOGÍA: FOSFATASA ÁCIDA (EXTRACCIÓN) 1. INTRODUCCIÓN

Código: BQ-ENZ-01 Vigente desde: Marzo de 2013 Tercera Versión

La gran mayoría de las reacciones químicas en los sistemas biológicos ocurren en presencia de proteínas específicas con actividad catalítica denominadas enzimas. La presenciade una enzima se detecta por las reacciones específicas que cataliza y su cinética puede ser modelada mediante aproximaciones como las de Michaleis-Menten. Diferentes parámetros termodinámicos como el pH, T, fuerza iónica y P tienen influencia en la actividad enzimática, del mismo modo que la presencia de inhibidores. Las fosfatasas ácidas son un grupo de enzimas similares, que catalizan laliberación de ácido fosfórico de algunos esteres monofosfóricos a un pH de 4 a 6. Son por tanto fosfohidrolasas ortofosfóricas (Clasificación EC 3.1.3.2):

Gráfica 1. Reacciones catalizadas por fosfatasas. Coeficiente de absortividad molar 18,45x103 M-1cm-1 del p-nitrofenóxido a 405 nm.

Las hidrolasas se caracterizan por la propiedad de romper moléculas de agua y de sustrato para incorporar losiones OH – y H+ derivados de la hidrólisis; es por eso que las fosfatasas son consideradas hidrolasas (gráfica 1) Durante la siguiente práctica se extraerá la fosfatasa ácida presente en germen de trigo. Esta enzima es bastante inespecífica y ataca cualquier sustrato que tenga un grupo éster fosfato, a la vez es un ejemplo de enzima cuya actividad puede ser medida por un método colorimétrico. Elp-nitrofenilfosfato (p-NFP), incoloro en solución acuosa, por acción desfosforiladora pierde su grupo fosfato y se transforma en pnitrofenol (p-NF), producto coloreado que en solución alcalina acuosa absorbe a 405 nm. REALIZADO POR: Dr. César Godoy. Dr. Jaime Restrepo. T.Q. Andrés Felipe Chamorro REVISADO POR: Dr. César Godoy Aprobado por: Dr. César Godoy

Digitado por: T.Q. Andrés Felipe Chamorro/ César Godoy / Laura Salas

UNIVERSIDAD DEL VALLE FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS Departamento de Química Bioquímica ENZIMOLOGÍA: FOSFATASA ÁCIDA (EXTRACCIÓN) 2. OBJETIVOS PRINCIPALES
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Código: BQ-ENZ-01 Vigente desde: Marzo de 2013 Tercera Versión

Familiarizar al estudiante con la metodología básica de caracterización cinética de una enzima. A partir de los resultadosobtenidos realizar relaciones entre la estructura y la función de la enzima, el sustrato y demás moléculas claves en la catálisis de la reacción estudiada.

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3. PREINFORME.
Como siempre, incluya diagrama de flujo sobre los procedimientos a seguir; el trabajo es bastante en esta práctica, desde antes, planee cómo se va a organizar con su/s compañero/s. Trate de resolver ANTES de la práctica lasdudas que se le presenten con el profesor. Recuerde fichas de seguridad y de tratamiento de los reactivos empleados. I. II. Dibuje la estructura de cada uno de los compuestos a utilizar en esta práctica. Traiga cronómetro. Averigüe dentro de qué tipo de enzimas se encuentran las fosfatasas (p.ej. hay ácidas y alcalinas). Investigue además sobre sus mecanismos de reacción y su función biológica. ¿Elsustrato empleado es uno natural o sintético? ¿Cuáles son los sustratos naturales de las fosfatasas? ¿Qué función tiene el glicerol presente en el extracto enzimático? ¿Qué funciones tiene el KOH 2M que se pone durante los ensayos? Explíquelo en términos bioquímicos. Traiga material para rotular tubos de ensayo y un filtro de tela según FASE I “B”.

III. IV. V. VI.

4. SOLUCIONES DE TRABAJOTabla 1. Soluciones de trabajo para la fase l y la fase ll SOLUCIÓN C (mM) SOLUCIÓN Buffer acetato pH=5,7 250 pNFP Buffer pH 2 (HCl en agua) 10 MgCl2 Buffer pH 3 (HCl en agua) 20 KOH Buffer pH 4 (acetato) 250 Buffer pH 7 (Tris) Buffer pH 5 (acetato) 250 Buffer pH 9 (Tris) C=concentración, mM=milimolar REALIZADO POR: Dr. César Godoy. Dr. Jaime Restrepo. T.Q. Andrés Felipe Chamorro REVISADO POR: Dr....