Fosfatasa alcalina

CINETICA ENZIMATICA: VALORACION DE FOSFATASA ALCALINA

1.- FUNDAMENTO TEORICO

1.1.- CINÉTICA ENZIMÁTICA

Las reacciones químicas en los sistemas biológicos sólo ocurren a velocidad adecuada en presencia de catalizadores específicos, que son las enzimas (E). Toda reacción enzimática puede esquematizarse como sigue:

E + S E + P

Así, E se combina con unsustrato (S) que se transforma en un producto (P). El tiempo que tarda una determinada cantidad de S en transformarse en P es lo que caracteriza a la enzima, y se denomina velocidad o actividad enzimática (v) que se define como cantidad de sustrato transformado o de producto formado en la unidad de tiempo.

- d [S] d [P]
v = =
dt dt

Para muchas enzimas, lavelocidad de catálisis, v, varía con la concentración de sustrato (S) en la forma que muestra la fig.1.
[pic]
1
|Figura 1: representación de v en función de [S], para una enzima que obedece |Figura 2: representación de dobles recíprocos de la |
|la cinética de Michaelis-Menten. |cinética enzimática |

Losparámetros cinéticos de una enzima, Vmáx. y KM pueden calcularse utilizando distintos tipos de representación gráfica. Uno de ellos es el de dobles recíprocos que aparece en la figura 2 y se utiliza posteriormente en esta práctica.

1.2.- MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
Los métodos más comunes de valoración de enzimas son:
a) Volumétricos, cuando en la reacción enzimática se consume o seproduce un producto gaseoso.
b) Colorimétricos, cuando el producto formado es coloreado o da color en una reacción posterior.
c) Espectrofotométricos, para aquellas reacciones enzimáticas que utilizan NAD(P) o NAD(P)H como coenzimas.
d) Radiométricos, utilizando un sustrato marcado radiactivamente.

1.3.- FOSFATASA ALCALINA
Las fosfatasas alcalinas son un grupo de isoenzimas quecatalizan la liberación de ácido fosfórico de algunos ésteres monofosfóricos, a un pH elevado:

R-O-PO3H2 + H2O ( R-OH + H3PO4

Existen diferentes fosfatasas alcalinas en los diferentes tejidos (hueso, riñón, hígado, placenta, tejido tumoral). La actividad fosfatasa alcalina presente en suero puede ser, por tanto, una mezcla de isoenzimas de los tejidos. Los niveles de fosfatasa alcalina en suerose ven elevados en enfermedades óseas y hepáticas; fue la primera enzima del suero que se estudió en una enfermedad hepática y ha sido utilizada ampliamente para el diagnóstico diferencial de la ictericia, enfermedades óseas y en algunos procesos cancerosos.
La fosfatasa alcalina es un ejemplo de enzima cuya actividad puede ser medida por un método colorimétrico. Este se basa en latransformación de un sustrato, el p-nitrofenilfosfato (p-NFP), en p-nitrofenol (p-NF), producto de color amarillo que en solución alcalina absorbe a 405 nm.

BIBLIOGRAFIA
- RICHTERICH, R y COLOMBO, J.P. Química Clínica. Ed Salvat pg 404 (1983)
- DIXON,M.y WEBB,E.C. Enzymes. Ed. Loongman London pg 343-635 (1979).
- BOWES,G.N. y Mc COMB R.B. Measurement of total alkaline phosphatase activity in humanserum. Clin.Chem. 21 (1988)
- BOWES,G.N. y Mc. COMB R.B. A continous spectrophotometric method for measuring the activity of serum alkaline phosphatase. Clin. Chem. 12, 70 (1966).
- Recommended methods for the determination of four enzymes in blood. Scand.J.Clin.Invest. 33, 291 (1974).
2.- MATERIAL Y REACTIVOS
- Tubos de ensayo, colorímetro y cubetas de colorímetro
- Tampóncarbonato/bicarbonato 20 mM, pH 10,5
- Producto: p-nitrofenol (p-NF) 0,625 mM
- Sustrato: p-nitrofenilfosfato (p-NFP) 10 mM
- NaOH 0,2 M
- Muestra: extracto de hueso

3.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Y TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS

3.1.- Curva de calibrado de p-NF

La primera parte de la práctica consiste en la obtención de la curva de calibrado del p-nitrofenol (pNF), que se utilizará en el...