Fosfatasa

Objetivo:

Determinación de VM y KM en condiciones normales y en presencia de activador.

Reactivos usados:

- p-nitrofenil fosfato 5,6 mM
- Buffer carbonato 0,1M, pH= 10,1
- NaOH 0,02 N
- MgCl2 25 mM

Fundamentos teóricos:

La fosfatasa alcalina (pH óptimo 9-10) se halla en hueso, riñón, hígado e intestino, y actúa sobre los ésteres fosfóricos liberando fosfato inorgánico.

Parasu determinación se utiliza como sustrato p-nitrofenilfosfato (incoloro), el que hidroliza liberando fosfato y p-nitrofenol (amarillo), que absorbe a 405 nm.

El sustrato no absorbe a esa longitud de onda, de manera que el curso de la reacción catalizada por la enzima puede ser seguido fácilmente, midiendo el cambio de extinción a 405 nm. La actividad de la fosfatasa alcalina se ve incrementadapor la acción de iones divalentes, como Mg2+.

Desarrollo de la práctica:

Se utiliza como fuente de enzima suero humano y como sustrato p-nitrofenilfosfato 5,6 mM en buffer carbonato 0,1 M, pH=10,1.

a) Se siguen las indicaciones del cuadro, efectuando un blanco:

Sustrato Buffer Suero Tubo
0,05 1,65 --- 1
0,05 1,45 0,2 2
0,1 1,4 0,2 3
0,2 1,3 0,2 4
0,3 1,2 0,2 5
0,4 1,1 0,2 60,6 0,9 0,2 7
1,0 0,5 0,2 8
1,2 0,3 0,2 9

Incubar 15 minutos a 37ºC.
Agregar 3 ml de NaOH 0,02 N a cada tubo, mezclar inmediatamente y leer a 405 nm.

b) Repetir el esquema anterior con el agregado de MgCl2 25 mM.

Sustrato Mg2+ Buffer Suero Tubo
0,05 0,2 1,45 --- 1
0,05 0,2 1,25 0,2 2
0,1 0,2 1,2 0,2 3
0,2 0,2 1,1 0,2 4
0,3 0,2 1,0 0,2 5
0,4 0,2 0,9 0,2 6
0,6 0,2 0,7 0,2 7
1,0 0,20,3 0,2 8
1,2 0,2 0,1 0,2 9

Incubar 15 minutos a 37ºC.
Agregar 3 ml de NaOH 0,02 N a cada tubo, mezclar inmediatamente y leer a 405 nm.

Datos experimentales obtenidos y cálculos correspondientes:

Experiencia a (sin Mg2+)
Tubo Absorbancia registrada Absorbancia p-nitrofenol (se resta el bco de Rvo.)
1 0,021 0,000
2 0,125 0,104
3 0,167 0,146
4 0,269 0,248
5 0,3480,327
6 0,374 0,353
7 0,458 0,437
8 0,494 0,473
9 0,513 0,492

Experiencia b (con Mg2+)
Tubo Absorbancia registrada Absorbancia p-nitrofenol (se resta el bco de Rvo.)
1 0,133 0,000
2 0,195 0,062
3 0,328 0,195
4 0,425 0,292
5 0,546 0,413
6 0,602 0,469
7 0,675 0,542
8 0,698 0,565
9 0,718 0,585

Para determinar la concentración de sustrato en cada tubo:

Vi . Ci = Vf . Cf
donde:Vi: Volumen inicial de sustrato en cada tubo
Ci: concentracion inicial de sustrato (5,6 mM)
Vf: Volumen final en cada tubo, luego del agregado de buffer y suero (y sc de Mg2+ en la experiencia b)
Cf: concentración final de sustrato (en el volumen final)

Experiencia a (sin Mg2+)

Tubo 1:
Al no haber enzima, no hay p-nitrofenol capaz de absorber (sigueintacto el p-nitrofenilfosfato). La absorbancia registrada se debe al H2O, por lo que este tubo no se tiene en cuenta para la gráfica. Se considera que a concentracion de producto nula, no hay absorbancia y la curva parte del centro de coordenadas.

Tubo 2:

Vi . Ci = Vf . Cf
0,05ml . 5,6mM = 1,7ml . Cf
0,05ml . 5,6mM = Cf
1,7ml
0,16mM = Cf

Tubo 3:

Vi . Ci = Vf . Cf
0,1ml .5,6mM = 1,7ml . Cf
0,1ml . 5,6mM = Cf
1,7ml
0,33mM = Cf

Tubo 4:

Vi . Ci = Vf . Cf
0,2ml . 5,6mM = 1,7ml . Cf
0,2ml . 5,6mM = Cf
1,7ml
0,66mM = Cf

Tubo 5:

Vi . Ci = Vf . Cf
0,3ml . 5,6mM = 1,7ml . Cf
0,3ml . 5,6mM = Cf
1,7ml
0,99mM = Cf
Experiencia b (con Mg2+)

Tubo 1:
Al no haber enzima, no hay p-nitrofenol capaz de absorber (sigue intacto elp-nitrofenilfosfato). La absorbancia registrada se debe al H2O, por lo que este tubo no se tiene en cuenta para la gráfica. Se considera que a concentracion de producto nula, no hay absorbancia y la curva parte del centro de coordenadas.

Tubo 2:

Vi . Ci = Vf . Cf
0,05ml . 5,6mM = 1,7ml . Cf
0,05ml . 5,6mM = Cf
1,7ml
0,16mM = Cf

Tubo 3:

Vi . Ci = Vf . Cf
0,1ml . 5,6mM =...