Fosfatasa

Datos:

* Longitud de onda 410 nm
* Buffer de glicina 0.05 M
* Solución fosfato disodico 0.5 M
* Solucion p-Nitrofenol (PNP) 10-4 M
* Solución acuosa de ZnCl2 6x10-4
* Suero fetal bovino 0.5x10-2
* Solución acuosa p-Nitrofenilfosfato (PNPP) 5x10-3 M
Tabla 1. Curva de calibración p-Nitrofenol TUBO | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | BLANCO |
Dilución PNP | 1 | 1/2 | 1/4 |1/8 | 1/16 | |
PNP (ml) | 6 | 3 | 3 | 3 | 3 | 0 |
Buffer glicina (ml) | 0 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
Fosfato disodico (ml) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
Cloruro de zinc ZnCl2 (ml) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
Tabla 2. Influencia de la concentración del sustrato sobre la velocidad de una reacción enzimática TUBO | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | BLANCO |
Dilución PNPP | 1 | 1/2 | 1/4 |1/8 | 1/16 | |
PNPP (ml) | 2 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 |
Buffer glicina (ml) | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 |
sacar de la solución anterior |
(ml) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0 |
Buffer glicina (ml) | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 2.0 |
Cloruro de zinc ZnCl2 (ml) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
DEJAR EN REPOSO 5 MIN – CALENTAR 37 °C 5 MIN |
*SUERO FETAL BOVINO (ml) | 0.5 | 0.5 | 0.5| 0.5 | 0.5 | 0.5 |
REACCION 15 MINUTOS 37°C |
+FOSFATO DISODICO (ml) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0.5 |
*calentado durante 5 minutos a 37°CEl suero fetal bovino se adiciona:Tiempo 0: blancoTiempo 1: tubo 5Tiempo 2: tubo 4Tiempo 3: tubo 3Tiempo 4: tubo 2Tiempo 5: tubo 1+ el fostato disodico se adiciona:Tiempo 15: blancoTiempo 16: tubo 5Tiempo 17: tubo 4Tiempo 18: tubo 3Tiempo 19: tubo 2Tiempo 20:tubo 1Tabla 3.determinacion del tipo de inhibición TUBO | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | BLANCO |
Dilución PNPP | 1 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | |
PNPP (ml) | 2 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 |
Bugffer glicina (ml) | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 |
sacar de la solución anterior |
(ml) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0 |
Buffer glicina (ml) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1.5 |
Cloruro de zinc ZnCl2 (ml) | 0.5 | 0.5 | 0.5 |0.5 | 0.5 | 0.5 |
DEJAR EN REPOSO 5 MIN – CALENTAR 37 °C 5 MIN |
*SUERO FETAL BOVINO (ml) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
REACCION 15 MINUTOS 37°C |
+FOSFATO DISODICO (ml) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0.5 |
*calentado durante 5 minutos a 37°CEl suero fetal bovino se adiciona:Tiempo 0: blancoTiempo 1: tubo 5Tiempo 2: tubo 4Tiempo 3: tubo 3Tiempo 4: tubo 2Tiempo 5: tubo 1+ el fostatodisodico se adiciona:Tiempo 15: blancoTiempo 16: tubo 5Tiempo 17: tubo 4Tiempo 18: tubo 3Tiempo 19: tubo 2Tiempo 20: tubo 1Resultados: Tabla 4. Concentración PNP y absorbancias obtenidas PNP | E1 | E2 |
6,25E-06 | 0,07 | 0,068 |
1,25E-05 | 0,148 | 0,144 |
2,50E-05 | 0,287 | 0,284 |
5,00E-05 | 0,603 | 0,581 |
1,00E-04 | 1,176 | 1,153 |
Grafica 1. Absorbancia vs concentración PNP Tabla 5.Absorbancias influencia de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción [S] | |
PNPP | E1 |
3,91E-05 | 0,103 |
7,81E-05 | 0,132 |
1,56E-04 | 0,268 |
3,13E-04 | 0,468 |
6,25E-04 | 0,878 |
Grafica 2. Influencia de la concentración de sustrato sobre la velocidad de la reacción Grafica 3. [PNPP] | Absorbancia | [PNP] | [V0] | 1/[PNPP] | 1/V0 |
3,91E-05 | 0,103 |9,10819E-06 | 6,07213E-07 | 2,56E+04 |   |
7,81E-05 | 0,132 | 1,16142E-05 | 7,74283E-07 | 1,28E+04 | 1291517,86 |
1,56E-04 | 0,268 | 2,33667E-05 | 1,55778E-06 | 6,40E+03 | 641937,87 |
3,13E-04 | 0,468 | 4,06498E-05 | 2,70999E-06 | 3,20E+03 | 369005,102 |
6,25E-04 | 0,878 | 7,60802E-05 | 5,07201E-06 | 1,60E+03 | 197160,382 |
[Inh] | |
PNPP | E1 |
3,91E-05 | 0,042 |
7,81E-05 | 0,039 |1,56E-04 | 0,052 |
3,13E-04 | 0,074 |
6,25E-04 | 0,123 |
[PNPP] | Absorbancia | [PNP] | [V0] | 1/[PNPP] | 1/V0 |
3,91E-05 | 0,042 | 3,83685E-06 | 2,5579E-07 | 2,56E+04 | 3909459,46 |
7,81E-05 | 0,039 | 3,5776E-06 | 2,38507E-07 | 1,28E+04 | 4192753,62 |
1,56E-04 | 0,052 | 4,701E-06 | 3,134E-07 | 6,40E+03 | 3190808,82 |
3,13E-04 | 0,074 | 6,60214E-06 | 4,40143E-07 | 3,20E+03 |...