Fraccion Nuclear

Universidad Andrés Bello
Facultad de Ciencias Biológicas
Laboratorio de Biología Celular y Genética
BIO-132











Informe Laboratorio N°10
Organización Subcelular

































Introducción:


Las células aparecieron sobre la tierra hace 3,5 billones de años, probablemente debido a la agregación espontánea de moléculas.Las primeras células eran relativamente simples y pequeñas, similares a los organismos que actualmente conocemos como procariontes. Luego aparecieron las células eucariontes, más grandes y de organización más compleja, que hoy forman parte de animales y plantas.
Por definición y, a diferencia de las células procariontes, las células eucariontes poseen un núcleo que contiene la mayoría del DNAenvuelto en una membrana. Esto deja al material genético en un compartimiento separado del resto de los contenidos de la célula o citoplasma, donde ocurren las reacciones metabólicas.
En el citoplasma se pueden distinguir varios organelos: cloroplastos, mitocondrias, retículo endoplásmico, aparato de Golgi, ribosomas, peroxisomas, lisosomas, citoesqueleto, los cuales cumplen funciones específicasdentro de la célula.
En este práctico se logrará dominar la organización subcelular, como lo son la membrana plasmática, mitocondrias, cloroplastos, Retículo endoplasmático, Aparato de golgi, etc.
Lo que se hará en el laboratorio será la identificación de algunas de estas organizaciones con un método llamado fraccionamiento subcelular que constituye dos etapas, la primera etapa es lahomogenización que se logra a través de diferentes procesos como sonificación, shock osmótico o simplemente moliendo la muestra que se quiere observar, y en este practico se utilizara solo moler la muestra y la segunda etapa se realiza a través de una serie de etapas sucesivas de centrifugación, donde finalmente se observaran en el microscopio las dos primeras centrifugaciones que es la separación denúcleos y mitocondrias, cloroplastos, lisosomas y peroxisomas.



Objetivos:

• Lograr por medio del fraccionamiento sub-celular la obtención de los organelos, y de este modo lograr observar al microscopio sus formas o diferencias por separado.

• Aprender, desarrollar y entender los métodos y técnicas de homogeneización que se utilizan en el fraccionamiento sub-celular.

• Entenderla forma de centrifugado que se debe utilizar para el fraccionamiento sub-celular

• Entender lo que significa “moléculas marcadoras” y la utilidad que pueden tener en el proceso de fraccionamiento sub-celular













Materiales y Métodos:

Fraccionamiento subcelular: Una vez recibida la muestra homogeneizada del hígado de raton en un tubo falcon (homogeneizado por elprofesor mecánicamente gracias al ultra-turrax), nos dirigimos al centrifugador, y colocamos la muestra a 4500x g por 2 minutos y 15 segundos. Despues de esperado el tiempo, obtuvimos una muestra con un precipitado y el sobrenadante. Sacamos el sobrenadante con una pipeta esteril, y lo colocamos en otro tubo (el tubo con el precipitado o pellet se mantiene en hielo mientras tanto) y este nuevotubo lo colocamos en la centrifugadora a 5000 x g por 30 minutos. Terminado el tiempo, repetimos el proceso de separar el sobrenadante con una pipeta esteril a otro tubo, y dejamos todo en hielo para su posterior utilización.

Observacion al microscopio: En este punto, tomamos una muestra del primer pellet obtenido, lo colocamos en un portaobjeto y agregamos una solución de azul de triptano parateñirla. Despues, le colocamos un cubreobjetos para su posterior observación. Lo mismo se hace para el segundo pellet obtenido.

Comparacion de muestras con marcadores específicos: Tomamos 4 tubos de ensayo, a los cuales le colocamos a cada uno alguna muestra especifica (Blanco , Fraccion nuclear o pellet 1, fracción mitocondrial o pellet 2, fracción microsomal o sobrenadante 2, en ese...