Fraccionamiento celular: obtención de mitocondrias

LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR
2ndo SEMESTRE
25/02/12
LUZ JIMENA CARDENAS SANCHEZ
ANDREA TORRERO DIAZ
DANIA MONTES DE OCA

Fraccionamiento Celular: obtención de mitocondrias

INTRODUCCION
Las mitocondrias son los orgánulos celulares encargados de suministrar la mayor parte de la energía necesaria para la actividad celular. Actúan, por lo tanto, como centrales energéticas de la célula ysintetizan ATP a expensas de los carburantes metabólicos (glucosa, ácidos grasos y aminoácidos). La mitocondria presenta una membrana exterior permeable a iones, metabolitos y muchos polipéptidos. 
Las mitocondrias no permanecen estáticas en la célula, al contrario, se mueven, cambian de tamaño y forma, se fusionan con otras mitocondrias o se dividen en otras más pequeñas. Su número suele ser variable,pudiendo ser sólo unas pocas o pasar del millar por célula.
El fraccionamiento celular es usado para investigar la bioquímica y fisiología de organelos fuera del ambiente complejo de la célula intacta. El objetivo principal  de este experimento es aislar las mitocondria del tejido de una coliflor por  el método de fraccionamiento celular.
Para preparar los tejidos para el fraccionamiento celular,primero se debe suspender en un medio apropiado (una solución amortiguadora, salina  ó azúcar isotónica). Para mantener  la integridad de los organelos y enzimas durante el procedimiento de la fraccionación, todas las soluciones y cristalería deben mantenerse frías.  Para los tejidos de plantas, la homogenización se debe realizar con un mortero.
Cada componente celular está sujeto a una fuerzacentrífuga. La fuerza generada por la centrífuga se expresa como fuerza centrífuga relativa
(RCF)en unidades de g.  La RCF es una función de velocidad de centrifugación en revoluciones por minutos (rpm) y la distancia de partículas desde el eje de rotación. Conociendo esta distancia (x) y el (rpm), se puede determinar el RCF de la ecuación: RCF = 1.19 x 10-5 (rpm)2x, donde x se toma como ladistancia (en cm) desde el eje de rotación hasta el margen de afuera del tubo de centrífuga.
OBJETIVO
Realizar fraccionamiento celular para reconocer algunos componentes celulares y la importancia de la técnica
HIPOTESIS: si se conocen los procesos que lleva acabo la mitocondria entonces se podrá determinar sus funciones y su morfología
MATERIAL Y MÉTODO
MATERIAL |
Navajas o bisturís Morteros Gasapara filtrar Tubos de centrifuga de15ml Tubos de centrifuga de 50ml Microtubos de 1.5 ml Reglas milimetradas Probetas de 10 ml Papel de lente Tinte verde Janus |

Pipetas de 10 ml/pipeteadores
Pipetas Pasteur
Hielo
Microscopios compuestos con vernier para medir
Laminillas y cubreobjetos 1 caja
Goteros
Aceite de inmersiónColiflor

METODOLOGÍA
OBTENCIÓN DE FRACCIONES MITOCONDRIALES

1. Se removió 20 g de la parte externa de una coliflor con un bisturí enseguida se coloco en un mortero frío con PBS 1X y se macero por 4 minutos.
2. Una vez transcurrido los minutos se filtro la suspensión a través de 4 capas de gaza a un tubo de centrifuga y se dejo reposar por 2 minutos.
3. El sobre nadante se decanto ycentrifugo a 600 g por 10 min en un tubo a 4 °C.
4. Se decanto el sobre nadante post nuclear en un tubo de centrífuga y se colocó la pastilla nuclear en un baño de hielo.
5. El sobre nadante post nuclear se centrifugo a 10,000 g por 30 min a 0-4°C y durante la centrifugación se examino microscópicamente.
6. Se decanto y descarto el sobre nadante post mitocondrial y añadió 5 ml de PBS 1X frío ala pastilla mitocondrial.
7. Con una espátula se removió el pellet mitocondrial de las paredes del tubo de centrifuga y con una pipeta pasteur se resuspendo en el PBS 1X.
8. La suspensión mitocondrial se transfirió a un tubo de ensaye la cual fue colocado en baño de hielo

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LA FRACCION MITOCONDRIAL

1. 5 gotas fueron agregadas de la suspensión mitocondrial...