Fraccionamiento subcelular

Fraccionamiento subcelular
Universidad de Santiago de Chile
Facultad de Química y Biología.

Introducción
Debido al constante análisis de la célula y de sus estructuras se han desarrollado ciertas técnicas de separación de organelos, cada una diferente a la otra, dependiendo decuál sea el objetivo que se quiera analizar. La técnica más conocida con estos fines es el fraccionamiento subcelular, método que permite la purificación y análisis completo de los organelos presentes en esta unidad básica funcional de los organismos.
El fraccionamiento subcelular consiste en diferentes procesos a realizar, el primero de estos es la homogenización de la muestra, la cual puedeser llevada a cabo de diferentes maneras, tales como: un choque osmótico (inserción de la muestra celular en un medio hipotónico teniendo como consecuencia la citolisis), sonicación (exposición de la muestra a vibraciones ultrasónicas) o simplemente “moler” la muestra de forma manual. Mediante la centrifugación de las muestras homogenizadas, se logra separar por tamaño y densidad los diferentescomponentes.
El objetivo de este práctico es lograr manejar la técnica de fraccionamiento celular, conocer paso a paso este procedimiento, saber las condiciones que se requieren para lograr un mejor resultado de la muestra con el fin de poder ver las estructuras que conforman la célula a través del microscopio y por tinción.




Materiales y métodos
En esta oportunidad utilizamosmateriales tales como bisturí, tijeras, buffer de Lisis, para lograr homogenizar la muestra, que resultó ser un hígado de rata de laboratorio.
Luego de obtener el homogenizado se utilizaron algunos materiales como un tubo de Eppendorf, en el cual se colocó la muestra, antes de llevarla a la centrifugadora. Para la etapa final, que era la observación de lo obtenido se ocupó el microscopio y 2 tipos detinciones, Giemsa y Azul tripán, ambas para lograr destacar ciertas estructuras.
La metodología de trabajo se basó en lograr un buen homogenizado de la muestra. Para esto se procedió a moler el hígado, más bien a picarlo con el bisturí y las tijeras, se le agregó a la muestra buffer de Lisis y posteriormente se utilizo el homogenizador. La muestra fue colocada en un tubo de Eppendorf, se sumergiópor unos minutos en hielo y transcurrido cierto tiempo, se insertó en la centrifugadora.
La muestra obtenida luego del proceso de centrifugación, se extrajo del tubo y sobre un portaobjetos se observó al microscopio, utilizando 2 tinciones, Giemsa y Azul tripán. Todos aquellos resultados observados se anotaron.












Resultados
Los resultados que se obtuvo en la primera partedel procedimiento, moler el hígado manualmente, fue que se consiguió degradar la muestra hasta un estado acuoso con pequeños trozos del hígado (figura 1), luego de esta solución se obtuvo una muestra homogeneizada, sin poder distinguir trozos del hígado de la rata y lista para poder ser centrifugada. Al utilizar el homogenizador se debe emplear de manera no constante, es decir por periodos queexcedan los 10 segundos ya que por el contrario, al utilizarlo por mucho tiempo se calienta la muestra debido a las revoluciones por minuto a la que gira el rotor de este instrumento, destruyendo las estructuras. En esta oportunidad se utilizo el homogenizador a 1600 rpm, que es una velocidad media, sabiendo que la mínima para este instrumento es de 500 rpm y la máxima es de 3200 rpm.Figura 1.
Posteriormente a la centrifugación se obtuvo una solución en que se podía distinguir físicamente dos fases de diferentes densidades y tonos de color, uno era más rojo y poco denso, la otra fase , que se encontraba en el fondo del tubo, era de un color rojo-grisáceo y se notaba que era mucho más denso.(Figura 2)....