Fraccionamiento

Módulo Práctico 3
OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE ALGUNAS FRACCIONES SUBCELULARES Objetivos:
• Introducción a los métodos de obtención de fracciones subcelulares: conceptos de homogeneización, centrifugación diferencial y en gradiente. • Identificación, caracterización y análisis de pureza de las fracciones subcelulares obtenidas (núcleos, mitocondrias y cloroplastos). Observación de la morfologíamicroscópica de los organelos aislados y/o en cortes.

Fraccionamiento subcelular:
Los métodos de microscopía permiten analizar en gran medida la anatomía y localización de los organelos celulares, pero si se quiere ahondar en su funcionamiento deben realizarse ensayos bioquímicos, para lo cual generalmente el primer paso es obtener fracciones enriquecidas en los distintos organelos. La obtenciónde esta fracción puede dividirse en dos partes denominadas homogeneización y fraccionamiento. La homogenización consiste en disgregar los tejidos en las células que los componen y luego realizar la lisis de las células, de tal modo que se liberen sus componentes, en particular sus organelos, sin que estos sufran mayores daños. El uso de instrumentos como morteros, jeringas, homogeneizadorespermiten la disgregación y lisis celular. Si se parte de un cultivo celular, no es necesario separar las células y se pasa directamente a la lisis celular. Para esto también existen diversas alternativas como el uso de detergentes que solubilicen las membranas, el shock osmótico y el uso de ultrasonido. Una vez que se tienen todos los componentes celulares libres, es necesario separarlos en fracciones,es decir, realizar su fraccionamiento. El método más utilizado para este fin es la centrifugación diferencial. Cuando los diferentes componentes celulares se encuentran suspendidos en un líquido, tienden a sedimentar hacia el fondo por el efecto de la gravedad. Para acelerar este proceso, se puede colocar a un tubo conteniendo esta suspensión en un rotor giratorio, de forma de someter a laspartículas a una fuerza centrífuga. Este procedimiento se denomina centrifugación, y el rotor especializado en el que se realiza se denomina centrífuga. ¿Qué sucede cuando las partículas suspendidas son sometidas a una fuerza centrífuga? Las partículas van a moverse hacia el fondo del tubo, pero a su vez dos fuerzas van a oponerse a este movimiento, la fuerza de fricción y la fuerza de flotación generadapor el líquido desplazado. Esta contraposición de fuerzas hace que eventualmente cada partícula sedimente a velocidad constante, de acuerdo a la siguiente ecuación: v = (m × ω2 × r) (1 - ρo/ρ) f m es la masa de la partícula, ω2r es la aceleración que se genera en el rotor, ρo es la densidad del líquido en el que están suspendidas las partículas, ρ es la densidad de la partícula y f es elcoeficiente de fricción de la partícula.

33

Rearreglando esta ecuación, obtenemos: v = m (1 - ρo/ρ) 2 f ω ×r Esta ecuación implica que, para una aceleración constante, la velocidad de sedimentación depende de la masa de la partícula, de su densidad y coeficiente de fricción, y de la densidad del líquido. En particular, mientras mayor sea la masa de la partícula, más rápido sedimentará. También valela pena notar que la partícula solo sedimentará si su densidad es mayor a la del líquido ( ρo/ρ < 1), mientras que si es igual o menor permanecerá quieta o flotará. El cociente v / (ω2 × r) es una constante que se denomina coeficiente de sedimentación, y la unidad en que se expresa es el Svedberg (S), en homenaje a uno de los pioneros de la centrifugación. Mientras más grande este coeficientemayor será la velocidad de sedimentación. Frecuentemente la velocidad de centrifugación se expresa indirectamente en términos de la fuerza centrífuga resultante y su relación con la constante g de gravedad. Por ejemplo, una velocidad correspondiente a 1000g es aquella a la cual las partículas son sometidas a una aceleración 1000 veces mayor que la gravedad. Puesto que los distintos componentes...