Fraccionamiento

UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES .U.D.C.A.
FRACCIONAMIENTO DE TEJIDOS ANIMALES.

1. OBJETIVOS:
* Emplear solucionas diferenciales y métodos de centrifugación para el fraccionamiento de un tejido animal en sus principales compuestos constitutivos.
* Caracterización de las biomoléculas constitutivas de los tejidos de acuerdo a sus propiedades químicas.
* Cuantificaciónde las biomoléculas constitutivas de los tejidos por gravimetría.
* Comparar los diferentes tejidos desde el punto de vista de sus componentes principales.
2. INTRODUCCIÓN.
Debido a las diferencias químicas que existen entre las moléculas, carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucléicos, estos presentan diferente solubilidad en ácido tipo tricloroacético (ATA), según temperatura y ensolventes orgánicos ; luego es posible utilizar estas características para descomponer los tejidos y separa dichos biocompuestos toda vez que han sido triturados y se han roto sus membranas celulares.
El ácido tricloroacético (ATC) (Cl3CCOOH) a baja temperatura, actúa de diferente forma sobre cada biocompuesto. Sobre Carbohidratos, a baja temperatura los monosacáridos son estables en medio ácido,mientras que en caliente, sufren deshidratación produciéndose frutales. Los polisacáridos en medio ácido sufren hidrólisis del enlace glucosídico, reacción que aumenta su velocidad a medida que se eleva la temperatura. A temeperaturas inferiores a 4°C su velocidad es tan lenta que para fines prácticos se considera que no ocurre. En general se dice que los carbohidratos son solubles en solución deATA al 20% a temperaturas inferiores a 4°C y que no sufren cambios químicos en estas condiciones.
Sobre lípidos: Por definición éstos compuestos son poco solubles en soluciones acuosas, por lo tanto no se extraen si se trata el tejido con soluciones acuosas de ATC.
Sobre proteínas: Estas forman sales insolubles en ácidos como el ATC y el perclórico y por tanto no son solubles en soluciones deATC al 20% en frío.
Sobre los ácidos nucléicos: Al igual que las proteínas, éstos ácidos son insolubles en soluciones frías de ATC. Además el DNA se encuentra unido a proteínas como las histonas, lo cual lo hace mas insoluble en estas condiciones.
En conclusión, al tratar un tejido animal previamente triturado con ATC al 20% y a 4°C y someter a centrifugación la suspensión resultante, en elsobrenadante se separan los azúcares, mientras que los lípidos, proteínas y ácidos nucleícos quedan en el residuo.
El etanol- éter- cloroformo (2:2:1) (V/V): Si el residuo de la extracción con ATC a 4°C se trata con una solución de etanol- éter- cloroformo, al solvente solo pasan lípidos, mientras que las proteínas y los ácidos nucléicos quedan en fase sólida.
Cloruro de sodio al 10% en caliente:,Si el residuo anterior se suspende en una solución de NaCl al 10% y se somete a baño de maría (92°C) durante 40 minutos, desnaturalizan las proteínas mientras que los ácidos nucléicos, principalmente el RNA queda en solución. Por lo tanto, con éste procedimiento es posible separar las proteínas de los ácidos nucléicos y si al sobrenadante se le agrega etanol absoluto en un volumen igual al doblede la solución original y se enfría e un baño de hielo durante 10 minutos, se obtiene un precipitado que puede ser separado por centrifugación y que contiene los ácidos nucléicos.
3. MATERIALES.
Hielo abundante Acido Tricloroacético (ATC) 20%
Etanol- Eter- Cloroformo (2:2:1) Cloruro de sodio (NaCl) 10%
Etanol al 95%
Balanza analítica Centrífuga
Tubos de vidrio Vidrio de relojHojas de bisturí Baño serológico a 92°C
Horno de secado Mortero
Papel aluminio Tejido según el grupo
Pipetas de vidrio hasta 2 mL
4. PROCEDIMIENTO
Cada grupo hará el fraccionamiento químico sobre 1 gramo de tejido determinado (grupo 1 y 2 : músculo; grupo 3 y 4: hígado; grupo 5 y 6: corazón; grupo 7 y 9: piel de pollo). Una vez extraído el órgano tomar el peso húmedo en...