Frotis Sanguineo Manual

Conteo Celular, paso a paso
PASO 1. Preparación de la muestra.
Dependiendo del tipo de muestra a medir, se
ha de habrá de prepararar una muestra con
una concentración apta para su recuento.
Típicamente, el rango de concentraciones que
permite contar el hematocitómetro está entre
250.000 células y 2,5 millones de células por
ml.
Intentaremos que la muestra tenga unaconcentración en torno a 10
6
(1 millón)
aplicando las diluciones correspondientes.
Por debajo de 250.000 células / ml (2,5 * 10
5
)la cantidad de células contadas no es
suficiente para poder dar una estimación lo
suficientemente fiable de la concentración
celular
1


1
Ver
http://www.celeromics.com/es/resources/docs/Articles/conteo-celular-con-concentraciones-bajas.htm, para una
demostración estadística de por qué ocurre esto.
1
1
1 1
2
1
2
1
3
2
1
3
2
1
La concentración óptima para conteo
en hematocitómetro es de 1 millón de
células por ml = 10
6
células /m

Por encima de 2,5 millones (2,5 * 10
6
) la
probabilidad de cometer errores de conteo
crece demasiado, y también el tiempo y
esfuerzonecesario para realizar un recuento
con fiabilidad. Por encima de esta
concentración es conveniente diluir la muestra
para acercar la concentración al rango
óptimo.

PASO 2. Introducción de la muestra en la
cámara de Neubauer
Se toman 10 uL de la mezcla preparada en el
paso 1 con la micropipeta.
1) Se coloca un cubreobjetos sobre la
cámara de Neubauer, y se coloca enposición horizontal sobre la mesa, en
un lugar donde nos sea cómodo
pipetear.
2) se introduce una punta desechable
en el extremo de la micropipeta,
3) se ajusta la micropipeta para
succionar 10 uL de líquido.
Generalmente este ajuste se realiza
guirando el botón del embolo para
seleccionar el volumen deseado.
4) se introduce la punta de la
micropipeta en la muestra
5) Se pulsa elpistón o embolo superior
de la pipeta suavemente hasta que
se siente como el pistón llega al final
de su recorrido.
6) Se saca la punta de la pipeta de la
muestra, y siempre manteniéndola
en posición vertical se lleva hasta la
cámara de Neubauer.
7) Se coloca la punta de la pipeta en el
borde del cubreobjetos, en el
extremo de la cámara de Neubauer.
Se trata de dejar que ellíquido
penetre entre la cámara y el
cubreobjetos desde el lateral, por
capilaridad.
8) Se suelta el pistón suavemente
mientras se supervisa que el líquido
está entrando correctamente y de
forma uniforme en la cámara.
(ver Fig.5)
9) En caso de que aparezcan burbujas,
el cubreobjetos se haya movido o
algo no haya salido bien, repetir la
operación
Ya tenemos la cámara de Neubauercargada,
lista para el recuento celular.
Fig 5. Introducción de la muestra en la cámara de Neubauer
PASO 3. Preparación y enfoque del
microscopio.
1. Colocar la cámara de Neubauer en la
bandeja del microscopio. Si el
microscopio dispone de pinza de
sujeción, fijar la cámara con ella.
2. Encender la luz del microscopio.
3. Enfocar el microscopio hasta que
pueden verse nítidas lascélulas
mirando por el binocular.
4. Buscar el primer cuadro donde vaya
a realizarse el recuento. En este
ejemplo vamos a contar 5 cuadros
grandes de una cámara de
Neubauer Improved de 0,1mm de
profundidad. Ver Fig. 8
Ver
http://www.celeromics.com/es/resources
/docs/Articles/easy-formula-for-manualcell-counting.htm, para ver las fórmulas a
aplicar en cada una de las cámaras derecuento más comunes.
5. Realizar el recuento de células en el
primer cuadro.
Existe una convención por la cual si
las células tocan el límite superior o el
límite izquierdo del cuadro, deben
contabilizarse, pero no se
contabilizan si tocan el límite inferior o
el límite derecho.
Fig. 7. Recuento con alta concentración
celular.
En caso de que la concentración celular sea...