Fundamento de espectrofotometría

(Cumplimiento de la Ley de Lambert-Beer y análisis de mezclas) ____________________________________________________________

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Práctica de espectrofotometría UV-Visible

FUNDAMENTO DE LA TÉCNICA
Como es sabido, las técnicas espectroscópicas se basan en la interacción de la radiación electromagnética con la materia. A través de esta interacción las moléculaspueden pasar de un estado energético, m, a otro estado energético distinto, l, absorbiendo una cantidad de energía radiante igual a la diferencia energética existente entre los dos niveles: que:

E l − Em . Para conseguir esto, las moléculas absorben un fotón de una radiación tal ∆E = hν = κ

hc

∆E

El Em

h = Constante de Planck= 6.63.10-34 J.s

ν = Frecuencia de la radiación= κ

cc = velocidad de la luz=3.1010 cm.s -1 λ = longitud de onda Estos tránsitos energéticos son los que dan origen a los espectros que, en definitiva, no son mas que el registro de las distintas µ(o κ ) a las que se producen estos tránsitos energéticos. Debido a la existencia de diferentes tipos de energía: de los electrones en si, de los movimientos vibracionales de las moléculas, de la rotaciónde las mismas...etc, las moléculas pueden interaccionar con radiaciones electromagnéticas de un rango muy amplio de longitudes de onda, dando lugar a distintos tipos de espectroscopías según las diferentes regiones. Un esquema podría ser el siguiente:

λ / nm

10 10 10 10 10 10 10 Rayos γ Rayos x UV VIS INFRARROJO MICROONDAS ONDAS RADIO
Transitos electrones internos nucleares
400

1

23

4

5

6

9

electrones externos
500 600

Vibraciones
700

Rotaciones

RMN

violeta añil azul verde amarillo naranja rojo

La espectroscopía UV-Visible (espectros electrónicos), se debe a la transición de los electrones mas externos de los átomos de las moléculas, desde niveles fundamentales a niveles mas altos de energía.

Espectrofotometría

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LEY DELAMBERT-BEER
Si se hace incidir radiación monocromática sobre una muestra con una concentración “C” de una sustancia que absorbe a esa longitud de onda “λ”, la intensidad

de la radiación que la atraviesa, I, está relacionada con la intensidad incidente I 0 y con el espesor de la muestra,l , por la expresión :

I = I 0 ∃10 − ε l c
aplicando logaritmos: reordenando términos:

logI = log I 0 − εl c logI 0 − log I = ε l c I log I0 = ε l c

pudiéndose escribir :

I I0 se denomina “transmitancia” de la muestra y se suele Habitualmente, el cociente I expresar como porcentaje de luz transmitida: I0 ∃100 . Por otra parte, se define la “absorbancia” de la muestra como: A = log(1/T). Tanto la absorbancia como la transmitancia son magnitudes que se obtienen directamente en elespectrofotómetro. Segun estas definiciones, queda finalmente la siguiente expresión que se conoce con el nombre de la ley de Lambert-Beer:

A=εlc
donde ε es la “absortividad molar” (una medida de la radiación absorbida), que es un valor constante para cada sustancia a cada longitud de onda λ y en unas condiciones experimentales determinadas; también se denomina “coeficiente de extinción molar” si, como esfrecuente, la concentración se expresa en moles por litro. Si se opera, por tanto, a una longitud de onda dada y con una cubeta de un determinado espesor, l , la absorbancia A, medible directamente, es proporcional a la concentración molar de la muestra, c, lo que constituye el fundamento del análisis espectrofotométrico cuantitativo. Existen, sin embargo, distintos factores que afectan alcumplimiento de la ley de Lambert-Beer, especialmente a concentraciones elevadas. Por ello antes de proceder al análisis de una muestra es preciso comprobar experimentalmente el rango de concentraciones en que dicha ley se cumple, obteniendo la curva de calibrado que relaciona las absorbancias con las concentraciones.

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La ley de Lambert-Beer puede también aplicarse al...