Fundamento De Mlpa

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
CARRERA TECNOLOGIA MÉDICA

MULTIPLEX LIGATION-DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION
(MLPA)

Tecnología médica,
Mención laboratorio clínico, hematología y banco de sangre.
Asignatura: Genética y Biología Molecular.
Docentes: - Alicia Colombo.
- Iskra Signore.
Alumnos: - Sebastián Delgado M.
- María José López L
Fechade entrega: 22 mayo de 2012.
INTRODUCCION

MULTIPLEX LIGATION-DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION (MLPA) en español:Multiplex ligadura-dependiente de la sonda de amplificación, es una técnica que fue fundada en 1985, aunque algunas revisiones bibliográficas sugieren que fue descrita por primera vez por Schouten y sus colegas en el año 2002 (1)(2). Así como también sugieren que MLPA es una técnicavariante del conocido PCR, reacción de cadena en polimerasa. (3)
Multiplex ligadura-dependiente de la sonda de amplificación (MLPA), es la técnicafrecuentemente utilizada para la detección de las variaciones del número de copias; perdida y/o ganancia, de secuencias de ADN genómico en una muestra problema.
Esta metodología permite mediante hibridación, ligación de sondas específicas,amplificaciones y migración capilar, el análisis de diversos tipos de marcadores genéticos para un gran número de aplicaciones: detección de metilación, delación, duplicación del material genético; entre otros…

Es una técnica cuantitativa, ya que puede cuantificar hasta 40 genes distintos en una misma cantidad de ADN.

MLPA en la actualidad: cobra cada vez mayor importancia y es de gran apoyo para losavances que se realizan en el área medica actualmente, ya que nos permite el análisis de perfiles genómicos importantes para la investigación y diagnósticos de diversas patologías; así como también nos permite realizar hallazgos y prevención de distintas patologías en pacientes que cuentan con historiales clínicos de enfermedades hereditarias.

FUNDAMENTO DE MLPA.

Cada locus amplificable porPCR consiste en dos hemi-sondas, cada una de las cuales contiene la mitad de la secuencia blanco, un fragmento cebador variable en tamaño y uno de los cebadores necesario para la amplificación. A diferencia de la técnica clásica de PCR multiplex, MLPA utiliza un único par de cebadores para amplifica todas las secuencias.
La reacción se puede dividir en 5 pasos:

Paso 1ºy 2º-. Desnaturalizaciónde ADN e hibridación con las sondas MLPA
El ADN se desnaturaliza y se incuba durante la noche con una mezcla de sondas de MLPA, las cuales constan de dos oligonucleótidos (secuencia corta de ADN o ARN, con cincuenta pares de bases o menos) diferentes, cada uno contiene la secuencia de los cebadores de PCR. Los dos oligonucleótidos de sonda hibridan con las secuencias diana inmediatamenteadyacentes.

Paso 3º-.Reacción de ligación
Únicamente cuando las dos sondas se encuentren hibridadas correctamente podrán ser ligadas.

Paso 4º-. Reacción de PCR
Luego de la ligación se amplifica por PCR.

Paso 5º-. Separación de los productos de amplificación por electroforesis
Los productos amplificados generan fragmentos de longitud variable que serán separados por electroforesis capilary analizados en un secuenciador automático, pudiéndose estimar la cantidad de producto obtenido mediante la emisión de un pico de señal.

Análisis de datos
Las sondas que no fueron ligadas, no podrán ser amplificadas exponencialmente, y por consiguiente no generaran señal. Los datos resultados serán analizados mediante un software.
El área de señal de intensidad de pico de los productos dePCR pueden ser medido, permitiendo inferir la cantidad de secuencia presente, una disminución del área de la señal indica deleción y un aumento indica duplicación.

Variantes de MLPA
Existen variantes de la técnica, como ser la RT-MLPA (reverse transcriptase MLPA), la cual resuelta muy útil en estudios de expresión génica. Rt-MLPA comienza con una transcripción reversa de ARNm a ADNc, para...