Fundamentos hplc

DESARROLLO DE METODOS EN CROMATOGRAFIA LIQUIDA
DE ALTA RESOLUCION. ESTRATEGIAS DE OPTIMIZACION.
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Conceptos básicos de cromatografía. Retención, selectividad,
resolución, eficiencia. Eficiencia y velocidad lineal. Tiempo de
análisis. (Cap. I)
Descripción del equipamiento básico en HPLC. Bombas,
degasificadores, inyectores, detectores, otros. (Cap. II)
Desarrollodel método cromatográfico. Propiedades físicas de la
columna. Elección del tipo de columna en función de las
características de la muestra. (Cap. III)
Pretratamiento de muestras (Cap. IV)
Distintos tipos de cromatografía: RPLC, NPLC, pares iónicos, IEC,
SEC, HIC, cromatografía quiral (Cap. V y VI)

Análisis cuantitativo por cromatografía líquida. (Cap. VII)
Elución en gradiente.Estrategias de optimización (Cap. VIII)

Esquema del proceso de elución
Cromatograma de elución

A

B
A

A y B: solutos (KB > KA)
E: eluyente

Separación de analitos A, B y C en el tiempo t o a lo largo
de la distancia z del punto de inyección

Procesos
dispersivos

En síntesis, la separación depende de:
1) migración diferencial entre componentes de la mezcla
2) dispersión de cadabanda controlada

Cromatografía líquida. Representación esquemática de la partición de
analito A entre fase móvil y fase estacionaria

Fase móvil, m
u0

A
Fase estacionaria, s

Interacciones posibles:

iónicas
polares
dispersivas
no interacción

Cromatografía líquida
Clasificación según el tipo de interacciones predominantes
Cromatografía de adsorción
de partición
de exclusiónde intercambio iónico
otros modos (HIC, afinidad, quiral)

Clasificación según la polaridad de la fase móvil
Cromatografía en fase normal

Cromatografía en fase reversa

Cromatografía líquida
Clasificación según la
composición de la fase móvil

isocrática
en gradiente

Clasificación según la
cantidad de muestra a separar

analítica
preparativa

Clasificación según el
tipode isoterma

lineal
no lineal

Cromatografía de elución analítica lineal

Tipos de isotermas. Efecto sobre el perfil de la
banda eluída

Teoría de Platos
Martin y Synge (1941) y Said (1956)
Tres platos consecutivos:

N=4

C

C

C

C

C

C

Teoría de Platos
Derivación de la ecuación que describe la curva de elución

dCm(p)
dv

 Cm(p 1)  Cm(p)


p=N

vN

Cm(N)

C0 e v

N!

Cm(p)= concentración de soluto en fase móvil en el plato p
Cm(p)= concentración de soluto en fase móvil en el plato (p-1)
C0 = concentración de soluto inicial (concentración en la muestra)

N= último plato de la columna
v = volumen de fase móvil que atravesó la columna

Teoría de Platos
Perfil de elución en función del volumen de eluyente. Columnas de
4, 9y 16 platos teóricos
N=4

Cm = f(v)

N=9
N = 16

Función de Gauss

N

Cm(N)  C0e



v = volumen medio
v = dispersión de la banda

( v  v )2
2 v 2

Teoría de Platos. Volumen de retención
Volumen de retención de un soluto, VR: volumen (mL) de fase
móvil que atraviesa la columna desde el punto de inyección hasta
el máximo del pico
Derivando la función de Poissonrespecto de v e igualando a cero:

VR = N(vM + K vs ) = VM + KVS

VM = volumen muerto de la columna
Vs = volumen de fase estacionaria en
la columna

Factor de retención de un soluto, k: relación entre el número de
moles de soluto en fase estacionaria y el número de moles de
soluto en fase móvil

ns
Vs VR  VM tR  tM
k
K


nM
VM
VM
tM

Parámetros cromatográficosfundamentales. Resumen

Volumen de retención

VR = VM + KVS

Volumen muerto

VM

Tiempo de retención

tR = tM (1 + k)

Tiempo muerto :

tM

Factor de retención

k = ns /nm= KVs/VM

Factor de selectividad

 = kA/kB

Parámetros cromatográficos fundamentales. Mediciones
sobre el cromatograma

Medición correcta de estos parámetros cromatográficos:

tR = tR,chr - tex
tM =...