Fundamentos Pcr
Páginas: 6 (1268 palabras)
Publicado: 2 de noviembre de 2012
FUNDAMENTOS DE LA TÉCNICA PCR
1
2
PCR ¿Qué es?
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
Técnica que nos permite amplificar selectivamente un segmento específico de DNA, hasta obtener una cantidad suficiente para su posterior manipulación
FOTOCOPIADORA MOLECULAR FORMA DE CLONACIÓN “ IN VITRO”
3
4
5
¿Cuáles son los fundamentos?
EXTENSIÓN DEL CEBADOR: La DNA polimerasarealiza la extensión del primer utilizando la cadena complementaria como molde
DNA Polimerasa 3’ dNTPs dTTP dATP dGTP dCTP 5’
+
Mg
++
5’
3’
6
EXTENSION DEL CEBADOR
Utilizando dos cebadores que son complementarios a los extremos 3’ del fragmento de DNA de doble cadena que queremos amplificar
5’
3’
DNA polimerasa
DNA Polimerasa 3’ 5’
7
¿Qué necesitamos?DNA molde
Tampón de la reacción (tris,BSA, K…)
Cebadores
Nucleotidos (dNTPs, A, C, G y T)
DNA polimerasa
Mg++
8
ELECCIÓN DE PRIMERS Programas de ordenador
. Primer express •PrimerGen searches strings of amino acid residues in order to reverse-translate oligonucletide primers of a desired range of lengths and maximum number of degeneracies. •Primer (Stanford) Sun Sparcstationsonly •Primer (Whitehead) Unix, Vms (and DOS and Mac if you can compile it) •Amplify, Bill Engels (Macintosh only), is for use in designing, analyzing, and simulating experiments involving the polymerase chainreaction (PCR). You can obtain your copy of Amplify here •PrimerDesign 1.04, a DOS-program to choose primer for PCR or oligonucleotide probes. See also the PrimerDesign Welcome Page. •PC-Rare, anew software by R. Griffais, which uses a rare octamer at the 3' termini of the primer. This powerful (but user friendly) software is available for Macintosh and Windows environment. •Primer Design, a Java applet by Luca Ida Giovanni TOLDO. •CODEHOP, PCR primers designed from protein multiple sequence alignments (Local mirror site at WIS). •Primer3, an online service to pick PCR primers fromnucleotide sequence. (Local mirror site at WIS). .NetPrimer (PREMIER Biosoft International). NetPrimer combines the latest primer design algorithms with a web-based interface allowing the user to analyze primers over the internet
- Evitar G y C en el extremo 3’
9
DNA polimerasas
Termolábiles: Tª óptima de actuación de 42ºC - DNA polimerasa I de E. Coli - Fragmento Klenow de DNA polimerasa -T4 DNA polimerasa Termoestables: Tª óptima de actuación de 72-74ºC - Taq DNA polimerasa - Tth polimerasa
10
Taq DNA Polimerasa es la polimerasa de elección
(no tienen actividad 3’-5’ exonucleásica)
PARA AUMENTAR LA FIDELIDAD No aumentar mucho los ciclos
No añadir cantidades excesivas de Cl2Mg Igual cantidad para los cuatro dNTPs y en la Disminuir el tiempo mínima concentración decada ciclo posible
11
Buffer de la reacción
La composición puede ser distinta según las casa comerciales. - ClK - Tris-ClH - Gelatina - DMSO - Detergentes: tritón... - BSA - PEG
Cloruro de Magnesio (MgCl2) Su concentración resulta fundamental para la optimización de la reacción
Contribuye a aumentar la temperatura de hibridación
[Mg] disminuyen la especificidad [Mg] aumentan laespecificidad
12
COMPONENTE H2O esteril Buffer PCR 10x dNTPs mix (25mM de cada uno)
VOLUMEN 20,7μL 2,5μL 0.2μL
CONCENTRACION FINAL
1X 200μM (cada uno)
Primer mix 0,4μL (25 pmoles/μL de cada primer) Taq DNA polimerasa DNA (100ng/μL) 0,2μL 1,0 μL
0,4μM (cada primer) 1U/25μL 100ng/25μL
13
14
15
16
“n CICLOS”: ciclo 4
“n CICLOS”: ciclo 5
17
La cantidadde DNA dobla teóricamente con cada ciclo de PCR, Después de cada ciclo, la cantidad de DNA es dos veces la del ciclo anterior.
Después de: - 2 ciclos tenemos 2 x 2 - 3 ciclos - 2 x 2 x 2 - 4 ciclos 2 x 2 x 2 x 2 Así, después de ciclos de N ciclos tendremos 2N. Pero la reacción no puede mantenerse indefinidamente, se alcanza una fase de meseta, según lo demostrado en las cifras que aparecen en...
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PCR ¿Qué es?
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
Técnica que nos permite amplificar selectivamente un segmento específico de DNA, hasta obtener una cantidad suficiente para su posterior manipulación
FOTOCOPIADORA MOLECULAR FORMA DE CLONACIÓN “ IN VITRO”
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¿Cuáles son los fundamentos?
EXTENSIÓN DEL CEBADOR: La DNA polimerasarealiza la extensión del primer utilizando la cadena complementaria como molde
DNA Polimerasa 3’ dNTPs dTTP dATP dGTP dCTP 5’
+
Mg
++
5’
3’
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EXTENSION DEL CEBADOR
Utilizando dos cebadores que son complementarios a los extremos 3’ del fragmento de DNA de doble cadena que queremos amplificar
5’
3’
DNA polimerasa
DNA Polimerasa 3’ 5’
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¿Qué necesitamos?DNA molde
Tampón de la reacción (tris,BSA, K…)
Cebadores
Nucleotidos (dNTPs, A, C, G y T)
DNA polimerasa
Mg++
8
ELECCIÓN DE PRIMERS Programas de ordenador
. Primer express •PrimerGen searches strings of amino acid residues in order to reverse-translate oligonucletide primers of a desired range of lengths and maximum number of degeneracies. •Primer (Stanford) Sun Sparcstationsonly •Primer (Whitehead) Unix, Vms (and DOS and Mac if you can compile it) •Amplify, Bill Engels (Macintosh only), is for use in designing, analyzing, and simulating experiments involving the polymerase chainreaction (PCR). You can obtain your copy of Amplify here •PrimerDesign 1.04, a DOS-program to choose primer for PCR or oligonucleotide probes. See also the PrimerDesign Welcome Page. •PC-Rare, anew software by R. Griffais, which uses a rare octamer at the 3' termini of the primer. This powerful (but user friendly) software is available for Macintosh and Windows environment. •Primer Design, a Java applet by Luca Ida Giovanni TOLDO. •CODEHOP, PCR primers designed from protein multiple sequence alignments (Local mirror site at WIS). •Primer3, an online service to pick PCR primers fromnucleotide sequence. (Local mirror site at WIS). .NetPrimer (PREMIER Biosoft International). NetPrimer combines the latest primer design algorithms with a web-based interface allowing the user to analyze primers over the internet
- Evitar G y C en el extremo 3’
9
DNA polimerasas
Termolábiles: Tª óptima de actuación de 42ºC - DNA polimerasa I de E. Coli - Fragmento Klenow de DNA polimerasa -T4 DNA polimerasa Termoestables: Tª óptima de actuación de 72-74ºC - Taq DNA polimerasa - Tth polimerasa
10
Taq DNA Polimerasa es la polimerasa de elección
(no tienen actividad 3’-5’ exonucleásica)
PARA AUMENTAR LA FIDELIDAD No aumentar mucho los ciclos
No añadir cantidades excesivas de Cl2Mg Igual cantidad para los cuatro dNTPs y en la Disminuir el tiempo mínima concentración decada ciclo posible
11
Buffer de la reacción
La composición puede ser distinta según las casa comerciales. - ClK - Tris-ClH - Gelatina - DMSO - Detergentes: tritón... - BSA - PEG
Cloruro de Magnesio (MgCl2) Su concentración resulta fundamental para la optimización de la reacción
Contribuye a aumentar la temperatura de hibridación
[Mg] disminuyen la especificidad [Mg] aumentan laespecificidad
12
COMPONENTE H2O esteril Buffer PCR 10x dNTPs mix (25mM de cada uno)
VOLUMEN 20,7μL 2,5μL 0.2μL
CONCENTRACION FINAL
1X 200μM (cada uno)
Primer mix 0,4μL (25 pmoles/μL de cada primer) Taq DNA polimerasa DNA (100ng/μL) 0,2μL 1,0 μL
0,4μM (cada primer) 1U/25μL 100ng/25μL
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“n CICLOS”: ciclo 4
“n CICLOS”: ciclo 5
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La cantidadde DNA dobla teóricamente con cada ciclo de PCR, Después de cada ciclo, la cantidad de DNA es dos veces la del ciclo anterior.
Después de: - 2 ciclos tenemos 2 x 2 - 3 ciclos - 2 x 2 x 2 - 4 ciclos 2 x 2 x 2 x 2 Así, después de ciclos de N ciclos tendremos 2N. Pero la reacción no puede mantenerse indefinidamente, se alcanza una fase de meseta, según lo demostrado en las cifras que aparecen en...
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