fusion transcrpcional

Construcción de fusiones individuales dirigidas copia lac utilizando lambda Red y recombinación específica de sitio mediada por FLP en bacterias.
Ellermeier CD 1, Janakiraman A , Slauch JM .
Información sobre el autor
1 Departamento de Microbiología de la Universidad de Illinois, Urbana-Champaign, B103 Química y Ciencias de la Vida Edificio MC110, 601 South Goodwin Avenue, Urbana, IL 61801,EE.UU..
Abstracto
Un método simple para la construcción de fusiones transcripcionales y traduccionales específicas para el operón lac usando FLP recombinación específica de sitio mediada se describe. Plásmidos que contienen genes condicionales lacZY sin promotor y el objetivo de reconocimiento de FLP (FRT) Sitio en ambas orientaciones se construyeron para generar fusiones transcripcionales. Delmismo modo, un plásmido utilizado para crear fusiones de traducción se construyó en el que se ha eliminado el inicio de la traducción endógena de lacZ. Estos plásmidos pueden ser transformados en cepas que contienen un único sitio de FRT, que se integró previamente aguas abajo del promotor de interés usando el método de recombinación Red de lambda. La proteína FLP producido a partir de un plásmidoauxiliar que contiene un origen de replicación condicional promueve la recombinación específica de sitio entre los sitios FRT, lo que resulta en una fusión lac integrado para el gen de interés. Fusiones transcripcionales a la Salmonella typhimurium genes sodCII y Sita se construyeron utilizando este método y se muestran para responder adecuadamente a las mutaciones en los genes respectivosreguladores, rpoS y pieles. Fusiones de traducción también se construyeron utilizando este método. En este caso, la expresión de beta-galactosidasa fue dependiente de la traducción de la proteína diana. Dado que la recombinasa FLP no requiere factores del huésped para la función y que este método no requiere la clonación molecular, este método debe ser aplicable para el análisis de la expresión génica enuna variedad de organismos.


El uso de fusiones de genes para estudiar la transcripción y traducción
regulación está bien establecida (Hand y Silhavy,
2000; Manoil, 2000; Silhavy et al, 1984.; Silhavy y Beckwith,
1985; Slauch y Silhavy, 1991a). Fusiones en el lac
operón de Escherichia coli son especialmente útiles debido
la disponibilidad de numerosos indicador b-galactosidasa ymedios de lactosa para el aislamiento y caracterización de regulador
mutaciones. La expresión génica también puede cuantificarse
usando ensayos de b-galactosidasa simples (Slauch y Silhavy,
1991a). Con el advenimiento de la secuenciación del genoma, una gran
número de lectura abierta putativo marcos con ningún conocido
función han sido identificados. Para el estudio de la regulación deestos marcos de lectura abierta, un método simple para la
construcción de fusiones lac precisos se ha convertido en cada vez más
necesario.

Varios métodos para la construcción de fusiones de genes lac
existir. Uno de los métodos más comunes es para clonar el
promotor de los intereses aguas arriba del promotor lac
genes en un plásmido multicopia (Simons et al, 1987;. Slauch
ySilhavy, 1991a). Aunque simples, fusiones creados por este
método tiene problemas inherentes, que pueden incluir la titulación
reguladores de la transcripción debido a el número de copias de la
plásmido, leer a través de los promotores de plásmidos endógenos,
y fase de crecimiento alteración dependiente de copias del plásmido
número (Slauch y Silhavy, 1991a). Los métodos para la
conversión defusiones lac ubicados en plásmidos de múltiples copias en fusiones de copia única también se han desarrollado (Simons
et al, 1987.; Mano y Silhavy, 2000). La fusión lac es
recombinada a partir del plásmido en un derivado de fago
l, que luego es integrado en el cromosoma bacteriano
por cualquiera de l Int mediada por recombinación de sitio específico o Reca
la recombinación homóloga...