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Un microscopio electrónico es aquél que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imágenes de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar ampliaciones hasta 5100 veces más potentes que los mejores microscopios ópticos, debido a que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los fotones "visibles".

El primer microscopioelectrónico fue diseñado por Ernst Ruska y Max Knoll entre 1925 y 1930, quienes se basaron en los estudios de Louis-Victor de Broglie acerca de las propiedades ondulatorias de los electrones.

Un microscopio electrónico, como el de la imagen, funciona con un haz de electrones generados por un cañón electrónico, acelerados por un alto voltaje y focalizados por medio de lentes magnéticas (todo ello al altovacío ya que los electrones son absorbidos por el aire). Un rayo de electrones atraviesa la muestra (debidamente deshidratada y en algunos casos recubierta de una fina capa metálica para resaltar su textura) y la amplificación se produce por un conjunto de lentes magnéticas que forman una imagen sobre una placa fotográfica o sobre una pantalla sensible al impacto de los electrones que transfierela imagen formada a la pantalla de un ordenador. Los microscopios electrónicos producen imágenes sin ninguna clase de información de color, puesto que este es una propiedad de la luz y no hay una forma posible de reproducir este fenómeno mediante los electrones; sin embargo, es posible colorear las imágenes posteriormente, aplicando técnicas de retoque digital a través del ordenador. Elfraccionamiento celular es usado para investigar la bioquímica y fisiología de organelos fuera del ambiente complejo de la célula intacta. El objetivo principal de este experimento es aislar los cloroplastos, núcleo y mitocondria del tejido de plantas por el método de fraccionamiento celular. Los otros objetivos son examinar esas fracciones microscópicamente y estimar el coeficiente de sedimentación delos cloroplastos.

HOMOGENIZACIÓN

Para preparar los tejidos para el fraccionamiento celular, primero se debe suspender en un medio apropiado(una solución amortiguadora, salina ó azúcar isotónica). Para mantener la integridad de los organelos y enzimas durante el procedimiento de la fraccionación , todas las soluciones y cristalería debe mantenerse frías. Después de rebanar lashojas, el tejido está preparado para la homogenización, procedimiento que rompe los enlaces celulares y libera el contenido celular, sin dañar el medio en suspensión. La suspensión de células constituyentes se llama homogenado. Para los tejidos de plantas, la homogenización se debe realizar con un mortero(fig.1), al cual se le añade arena como abrasivo. En este proyecto los cloroplastos se aislaránde la espinaca; núcleos y mitocondria se aislarán de la coliflor.

CENTRIFUGACION

Debido a las diferencias en tamaño y densidad, cada componente celular está sujeto a una fuerza centrífuga. La fuerza generada por la centrífuga se expresa como fuerza centrífuga relativa(RCF)en unidades de g. La RCF es una función de velocidad de centrifugación en revoluciones por minutos (rpm) y ladistancia de partículas desde el eje de rotación. Conociendo esta distancia (x) y el (rpm), se puede determinar el RCF de la ecuación : RCF = 1.19 x 10-5 (rpm)2x, donde x se toma como la distancia (en cm) desde el eje de rotación hasta el margen de afuera del tubo de centrífuga.

CENTRIFUGACION DIFERENCIAL

En la centrifugación diferencial, el homogenado escentrifugado repetidas veces a altas velocidades ,sedimentándolo progresivamente en pequeñas partículas. El método está ilustrado en la fig. 2. La primera centrifugación es a 600g por 10 minutos, el cual sedimenta la fracción nuclear. Este “pellet” contiene el núcleo, células intactas y tejido.. L próxima separación es el sobrenadante postnuclear ó partículas suspendidas en líquido sobre el “pellet”...