Gel de proteínas y Western Blot

Gel de Proteínas y Western
Gel de proteínas
1) Preparar gel apropiado
2) Preparación de muestras: 20 µl de muestra más 5 µl de buffer, incubar en estufa o hervir según sea necesario.
3) Sembrar20 µl en cada pocillo y 7 µl de marcador de peso molecular
4) Correr gel
5) Luego de la corrida agregar HAc 10% para fijar.
6) Teñir el gel con Coomassie Blue
7) Desteñir con Solución DecoloranteWestern para geles sin teñir con Anti-his (Quiagen)
Transferencia
Antes marcar la membrana para identificar posición del gel
1) Armar sándwich: primero mojar bien todas las partes en buffer detransferencia, luego, sobre el lado negro:
Esponja
Whatman
Gel
Membrana
Whatman
Esponja
Lado transparente
2) Colocar en soporte el lado negro mirando a la parte negra del mismo
3) Llenar conbuffer de transferencia
4) Poner mosca
5) Transferir en cámara fría a 30 mA (deben pasar 900 mA a través de la mambrana)
Lavados
1) Teñir con Rojo Punceau y lavar rápido con agua destilada. Marcarcon lápiz los marcadores de peso molecular. Lavar con agua eliminando el exceso de colorante
2) Lavar 2 x 10 min con TBS
3) Bloquear con 3% BSA en TBS por lo menos 8 h
4) Lavar 2 x 10 min con TBSTween Tritón
5) Lavar 1 x 10 min con TBS
6) Incubar con Ac anti-His (mouse) dil 1/500 en TBS + BSA 3% (6µl en 3 ml)
7) Lavar 2 x 10 min con TBS Tween Tritón
8) Lavar 2 x 10 min con TBS
9) Incubar3 h con Ac anti-mouse dil 1/1500 en TBS + BSA 3% (7µl en 10 ml)
10) Lavar 4 x 10 min con TBS Tween Tritón
11) Enjuagar con Buffer fosfatasa alcalina (PA)
12) Revelar con 40µl NBT + 50 µl BCIP(20mg/ml) en 10 ml Buffer PA

Soluciones y buffers
Geles
Solución A: (Solución Stock de Acrilamida), 100 ml 30% acrilamida, 0.8% bis-acrilamida
29.2 g acrilamida + 0.8g bis-acrilamida, agregar aguadestilada hasta 100 ml
Solución B: (Buffer de separación 4X), 100ml
75 ml Tris-HCl 2M (pH 8.8) -------------- 1.5 M
4ml SDS 10% -------------------0.4%
21ml H2O destilada
Solución C: (Buffer de...