Generalidades Del Complejo Dentino Pulpar

ENZIMAS DE LA AMILASA SALIVAL
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
        Detectar la presencia o ausencia de actividad enzimática en saliva (actividad amilolítica) y en jugo de ananá (actividad proteolítica).
        Determinar el valor de la actividad enzimática variando algunos parámetros que la afectan (pH, temperatura).
Si en un extracto biológico se desea establecer la presencia de una determinadaproteína con actividad biológica, tal como una enzima, no basta con determinar la existencia de dicha proteína, sino que se requiere un ensayo que pruebe que la misma es biológicamente funcional. Cuando la actividad biológica es específica (como ocurre en el caso de las enzimas) resulta innecesaria la etapa de purificación, ya que la actividad biológica será evidenciable aún en presencia de otrasproteínas, aunque será necesaria la eliminación de cualquier sustancia que interfiera con su actividad.
Para medir la actividad enzimática sólo se requiere un método analítico sencillo que determine la desaparición del sustrato o la aparición de los productos de reacción.
 S
  | Enzima |  P
  |
Sustrato |   | Productos |

Para medir la influencia del pH, de la temperatura, de laconcentración de enzima, etc. sobre la velocidad de la reacción, debe realizarse dicha reacción variando el factor en estudio y dejando constantes todos los demás.
1. Degradación de almidón por acción de amilasa salival
Fundamento
El método se basa en la hidrólisis del almidón (sustrato), en condiciones de pH y temperatura fisiológicos, por acción de una amilasa presente en la saliva. Los productos dereacción son polisacáridos de menor peso molecular hasta llegar a disacáridos (maltosa), no evidenciables con el reactivo de Lugol (pero sí con Fehling).
2. Determinación de la actividad proteolítica de las enzimas presentes en el jugo de ananá
Fundamento:
El método se basa en la hidrólisis de la caseína (sustrato) por acción de enzimas proteolíticas (proteasas) en condiciones de pH ytemperatura adecuados, obteniéndose como producto de reacción péptidos de menor peso molecular, que no precipitan por el agregado de ácido tricloroacético y que pueden evidenciarse por medio de la reacción del biuret.
Medida de la actividad proteolítica

 
 
  | proteasas |   |
CASEÍNA | | péptidos pequeños |
 
La reacción se detiene por inactivación de la enzima proteolítica con ácidotricloroacético al 5% (TCA 5%). Es necesario realizar blancos de reacción (tiempo cero de la reacción) y para ello la enzima es inactivada con TCA 5% antes de la adición del sustrato.
La concentración de péptidos solubles en TCA formados luego de la reacción enzimática es directamente proporcional a la cantidad de caseína hidrolizada y por lo tanto es un medida directa de los productos de la reacciónproteolítica. Estos péptidos serán cuantificados por la reacción del biuret. Si deseamos conocer el tipo y número de péptidos formados se debe realizar un análisis por electroforesis.
Al detener la reacción con TCA (más aun si se defectúa a tiempos cortos) observaremos la presencia de un precipitado que corresponde a la caseína que no ha sido hidrolizada por la enzima. Este precipitado puederedisolverse con hidróxido de sodio al 10% y determinarse la concentración de proteínas por el método de Bradford, lo que proporcionará una medida indirecta de la actividad enzimática.

II. ENZIMAS
1. Degradación de almidón por acción de LA amilasa salival
1.1. Preparación de la solución stock de enzima
Colocar gotas de saliva diluídas en 0,5 ml de agua destilada.
1.2. Ensayo cualitativo.Detección de la atividad amilásica
        Agregar 0.5 ml de la solución stock de amilasa salival a un tubo “Lugol positivo” (solución de almidón más Lugol, color violáceo)
        A otro tubo “Lugol positivo” agregar 0,5ml de agua destilada
        Luego de unos minutos, el tubo con saliva comenzará a cambiar de color por desaparición del complejo almidón-yodo
        Anotar el cambio de color...