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PRÁCTICA Nº 7

OBJETIVO

Determinar las secuencias del ADN usando las autoradiografías propuestas.

SECUENCIACIÓN DE ADN

MARCO TEÓRICO
La última etapa de los análisis genéticos es la secuenciación de los fragmentos correspondientes a los genes que se desean estudiar. Cualquier método de secuenciación comienza con una población compuesta por un fragmento definido de ADN marcado en suextremo. A partir de esta población, se genera un conjunto de moléculas cuyo tamaño difiere en una sola base en el extremo no marcado. Posteriormente, estas moléculas se fraccionan mediante electroforesis en geles de acrilamida, tras ser convertidos en moléculas de ADN de cadena sencilla. La movilidad de estas cadenas es inversamente proporcional al logaritmo de su longitud. Esta técnica es tansensible que permite la separación de fragmentos cuya longitud difiere en un solo nucleótido. Para establecer la secuencia de nucleótidos, se determina la base que ocupa la última posición en el extremo truncado de las moléculas fraccionadas.
Existe tres métodos para la realizar la secuenciación del ADN: El método químico, método enzimático y el método por hibridación. El método químico y elenzimático, comparten algunos principios básicos. Por ejemplo, ambos han de marcar de algún modo las moléculas a secuenciar, bien radiactivamente o con fluorocromos. Otra de las características compartidas es la de generar fragmentos de ADN una sola hebra cuyos tamaños sólo se diferencian en una base. En el método secuenciación por hibridación se usan oligonucleótidos sintéticos inmovilizados paradeterminar la secuencia de un fragmento de ADN.








CUESTIONARIO
1. ¿Describa los diferentes tipos de secuenciación que existe?
Método químico de Maxam y Gilbert : Esta técnica consiste en romper cadenas de ADN de cadena sencilla marcadas radiactivamente con reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro bases. Los productos de estas cuatro reacciones se resuelven, porelectroforésis, en función de su tamaño en geles de poliacrilamida donde la secuencia puede leerse en base al patrón de bandas radiactivas obtenidas.

Método enzimático de Sanger : Se conoce como método de los terminadores de cadena o dideoxi. Para este método resulta esencial disponer de un ADN de cadena simple (molde) y un iniciador, cebador o "primer" complementario de una región del ADN moldeanterior a donde va a iniciarse la secuencia. Este cebador se utiliza como sustrato de la enzima ADN polimerasa I que va a extender la cadena copiando de forma complementaria el molde de ADN.

Secuenciación empleando cebadores fluorescentes: Se realizan cuatro reacciones de secuencia distintas en cada una de las cuales se añade el oligonucleótido o cebador marcado con una sonda fluorescente distintay un ddNTP diferente en cada una de ellas. Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en un único tubo.

Secuenciación empleando terminadores fluorescentes: Se realiza una única reacción de secuencia en presencia de los cuatro ddNTPs, cada uno de ellos marcados con una sonda fluorescente distinta.

La Pirosecuenciación también usa la polimerización del ADN para añadir nucleótidos,añadiendo cada vez un tipo diferente y despues detectando y cuantificando el número de nucleótidos añadidos a una determinada localización a través de la luz emitida por la liberación de los pirofosfatos unidos a ellos.

La "secuenciación por ligamiento" es otro método enzimático de secuenciación que emplea una ADN ligasa en lugar de una polimerasa para identificar la secuencia objetivo. Se usa en elmétodo polony y en la tecnología SOLiD que ofrece Applied Biosystems. Este método utiliza un reservorio de todos los oligonucleótidos posibles de una longitud dada, marcados de acuerdo con la posición secuenciada. Los oligonucleótidos se templan y ligan; el ligamiento preferente de las ADN ligasas por su secuencia específica produce una señal correspondiente a la secuencia complementaria en esa...