genetica extraccion de ADN

Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Publica
versión impresa ISSN 1726-4634
Rev. perú. med. exp. salud publica v.24 n.1 Lima ene./mar. 2007

ARTÍCULO ORIGINAL

Estandarización y validación de una prueba de PCR para el diagnóstico precoz de Leptospirosis humana.

Standardization and validation of the polymerase chain reaction for early diagnosis of human Leptospirosis

Manuel CéspedesZ1a; Rafael Tapia L1a ; Lourdes Balda J1b ; Dana González Q1a ; Carlos Peralta2a ; Patricia Condori2a

1 Laboratorio Referencia Nacional de Leptospirosis - Zoonosis Bacteriana, Centro Nacional de Salud Pública, Instituto Nacional de Salud. Lima, Perú.
2 Dirección de Salud de Madre de Dios. Madre de Dios, Perú.
a Biólogo.
b Técnico de Laboratorio.
RESUMEN

Objetivos: Estandarizar y optimizar laprueba de PCR dirigida al gen rrs (16S) de Leptospira spp., para luego validar su uso en muestras de pacientes con síndrome febril captados en zonas endémicas del Perú. Material y métodos: Se estandarizó y validó una prueba de PCR para el diagnostico rápido de leptospirosis en muestras de sangre y orina. Se optimizó la prueba con muestras de ADN de Leptospira de diferentes especies, y sedeterminó en 180 muestras clínicas de pacientes con sospecha de leptospirosis su sensibilidad y especificidad en comparación con la prueba de aglutinación microscópica (MAT) y ELISA IgM. Resultados: El PCR estandarizado amplificó el ADN de 25 serovares de seis especies de Leptospira spp. No amplificó las muestras de ADN de otros microorganismos patógenos. La sensibilidad y especificidad del método fue 100%in vitro. Su sensibilidad fue de 100% (IC95: 97,9 - 100%) en muestras de sangre antes de los ocho primeros días de enfermedad y de 30% (IC95: 16,3 - 43-,7) cuando el tiempo de enfermedad fue mayor. El PCR en orina tiene una baja sensibilidad. Conclusiones: El PCR estandarizado es más sensible que las pruebas serológicas en los primeros días de enfermedad y es poco sensible cuando la cargabacteriana es baja en sangre.
Palabras clave: Leptospira; Leptospirosis; Anticuerpos; Reacción en cadena de la polimerasa, Diagnóstico precoz (fuente: DeCS BIREME).

INTRODUCCIÓN
La leptospirosis es una enfermedad zoonótica de distribución mundial, causada por diversos serovares de Leptospira spp. patógenas; se adquiere cuando el hombre está en contacto directo o indirecto con orina contaminada1-3. En elPerú, está distribuida ampliamente, pero no se conoce la real proporción de febriles atribuidas a esta infección, porque no es considerada usualmente como una enfermedad de notificación y tampoco es incluida dentro del diagnóstico diferencial4-8; sin embargo, algunos estudios de vigilancia demuestran que es una causa muy frecuente de síndrome febril incluso mayor que el dengue en áreasendémicas9,10.
La enfermedad puede variar desde una infección subclínica hasta una enfermedad grave con falla multiorgánica11, debido a la gran variedad de signos y síntomas clínicos, la leptospirosis esta siendo confundida con otras enfermedades febriles como malaria, influenza, hepatitis, dengue, fiebre amarilla, enfermedad de Carrión, entre otras7-8.
La presencia de Leptospira spp. puede demostrarsemediante observación en microscopía de campo oscuro o por cultivo; pero el proceso es laborioso e incluso podría tardar hasta tres meses7. Los métodos de diagnóstico más usados están basados en la respuesta inmune del paciente frente a las leptospiras, como la prueba de microaglutinación (MAT) 12 y el ELISA IgM 13, que detectan anticuerpos contra Leptospira spp. en líquido cefalorraquídeo (LCR) ysuero, pero estas técnicas son poco sensibles en los primeros seis días de enfermedad y por tanto pueden ser inoportunas para el inicio de tratamiento7.

El diagnóstico precoz en leptospirosis es necesario, sobretodo en las formas graves de la enfermedad11; esto ha motivado el desarrollo de técnicas de PCR que han demostrado que pueden ser útiles en los periodos agudos de la infección14,15; sin...