genoma del virus de la rabia

Estandarización de la obtención de amplificados del genoma del virus de la rabia para su uso en estudios de epidemiología molecular

Con el fin de perfeccionar el diagnostico y la tipificación del virus de la rabia se estandarizaron técnicas para amplificar un fragmento de ADN complementario a una fracción de 902 nucleótidos seleccionados del ARN del virus de la rabia. La fracción mencionadacontiene secuencias que codifican para los aminoácidos 447-525 de la glicoproteína 1-35 de la proteína L. Además contiene la región intergenica no codificante conocida como Pseudogen Psi. En el presente estudio las técnicas estandarizadas consistieron en : amplificación biológica mediante reaislamiento del virus en ratón, la extracción del RNA del cerebro de ratón infectado y en la amplificaciónmolecular utilizando la técnica de transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) para obtener un fragmento de ADN complementario. En cuanto a la rabia se puede decir que es una zoonosis causada por virus neurotrópicos del genero Lyssavirus familia Rhabdoviridae que contiene ARN de cadena sencilla compuesto por 12000 nucleotidos el cual codifica cinco proteínas estructurales.El procedimiento que se realizo en este estudio fue el siguiente:
Amplificación biológica mediante el reaislamiento del virus rábico en ratón
Después de seleccionar los virus para el estudio, se aislaron nuevamente de la siguiente manera: 1g de cerebro infectado se maceró con 5 ml de una solución de suero normal de caballo al 2% penicilina 100 UI/ml y estreptomicina 100 μg/ml. Una vezcentrifugada la suspensión anterior durante 15 minutos a 8.000 g y temperatura ambiente, 30 μl del sobrenadante se inocularon en ratones ICR blancos suizos, machos, de 21 días de edad. La inoculación se hizo en cabina de flujo laminar, por vía intracerebral, utilizando una jeringa de 1 cc 26G 3/8 (BectonDickinson& Co.). Los ratones se observaron diariamente hasta la aparición de síntomas de rabia murina yse sacrificaron. Una vez extraidos, los cerebros se conservaron a-80 oC.

Extracción de ARN a partir del cerebroinfectado con el virus rábico

Para la extracción del ARN del virus rábico, se adaptó la técnica del trizol descrita por la compañía Gibco BRL-Life Technologies para la utilización del producto Trizol LS Reagent Cat. No.10296-028, con algunas modificaciones. Así, en un vial tipoEppendorff de 1,5 ml se mezclaron750 μl de TrizolLsReagent con 150 mg de cerebro de ratón ICR infectado con virus rábico. La mezcla se sometió a vórtex fuerte durante un minuto y se incubó a temperatura ambiente durante 5minutos. Posteriormente, se añadieron 300 μl de cloroformo, se mezcló por agitación y se incubódurante 15 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se centrifugó a 4 0C y 12.000 gdurante 15minutos. La fase acuosa superior se transfirió a un vial aparte, el cual contenía 500 μl de alcohol
isopropílico. La mezcla anterior se agitó vigorosamente y se incubó durante 15 minutos a
temperatura ambiente. La mezcla se centrifugó a 12.000 g y 4 oC durante 15 minutos, después delo cual se descartó el sobrenadante y se añadieron suavemente 500 μl de etanol al 70%sobre el pellet sinmezclar. El vial se centrifugó a 12.000 g y 4 oC durante 5 minutos, después delo cual se retiró la totalidad del sobrenadante y el pellet (que corresponde a ARN total de cerebrode ratón más ARN rábico) se resuspendió en 50μl de agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC)al 0,1%. El ARN tratado de esta manera se almacenó (en algunos casos durante más de dosaños) a -20 oC hasta el momento de hacer laamplificación por RT-PCR.

Iniciadores

Se utilizo el iniciador G(+) localizado entre los nucleótidos 4665 y 4687 del genoma con sentido positivo y secuencia 5’GACTTGGGTCTCCCAACTGGGG 3’ y el iniciador L(-) localizado entre los nucleótidos 5543 y 5566 del genoma con sentido negativo y secuencia 5’ CAAAGGAGAGTTGAGATTGTATC 3’.

Amplificación molecular de un fragmento de ADNc con la técnica de...