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“Informe LABORATORIOS CITOGENÉTICA: “cariotipo y fish””



Introducción
El genoma humano es toda la información genética que posee un individuo. Está compuesto por el genoma nuclear y el genoma mitocondrial. El genoma nuclear presenta en su interior moléculas de DNA, las cuales están organizadas con proteínas histonas formando una estructura básica llamada nucleosoma, que a medidaque se añaden proteínas y se pliega aumenta su condensación según la etapa del ciclo celular en que se encuentre.
Todas las células se encuentran en ciclo celular, pero pueden que estén proliferando o se hayan diferenciado para realizar una función específica. A pesar de esto todas las células de nuestro organismo presenta el mismo material genético y a las células diferenciadas se les puedeinducir entrar al ciclo proliferativo. También existe una regularidad en todas las mitosis de individuos de la misma especie, por lo que se pude dar una validez biológica a los estudios realizados en estas células en cuanto a su material genético.
La citogenética se encarga de estudiar la estructura, función y comportamiento de cromosomas divisionales mediante diversas técnicas y métodos, por lo quees necesario obtener cromosomas metafásicos, ya que en esta fase de la mitosis se alcanza el máximo de condensación de cromosomas, haciendo posible su visualización y análisis.
Los estudios se comparan con cariotipos estándares o patrón, pudiendo detectar alteraciones en el cariotipo a analizar como deleciones, inserciones, inversiones de segmentos cromosómicos, aneuploidias, trasnlocaciones,etc; utilizando técnicas como el bandeo G, que permite obtener bandas en los cromosomas, las cuales en un individuo normal son regulares en cada par cromosómico y distinto entre los demás cromosomas; y el FISH (hibridación in situ fluorescente) que permite identificar segmentos de DNA específicos utilizando una sonda complementaria al segmento de interés asociada a un fluoróforo.Objetivo General
Conocer, aplicar y desarrollar los métodos de estudios clásicos utilizados en citogenética

Objetivos Específicos
Obtención de cromosomas matafásicos a partir de un cultivo de linfocitos
Realizar un cariotipo con los cromosomas obtenidos mediante Bandeo G
Realizar una Hibridación in situ fluorescente (FISH)


Materiales y Métodos
1) Obtención de placas metafásicas a partirde linfocitos de sangre periférica humana.
Protocolo
Siembra
Se realizó un cultivo de linfocitos a partir de sangre periférica total humana (5 ml) en el cual se utilizó como medio de cultivo PB-MAX™ GIBCO (3 ml) .Este medio contiene Phytohemoaglutinina. Luego se puso la mezcla a incubar en una estufa a 37°C por 72 horas aproximadamente.
Cosecha
Agregar Colchisina 1hora 30 minutos atemperatura ambiente antes de comenzar a hacer la cosecha. Centrifugar muestra, agregar KCl 0.05M a 37°C al pellet resultante agitando e incubar a 37°C por 12 min.
Centrifugar nuevamente la mezcla, eliminar el sobrenadante y agregar ácido acético al 4% con agitación. Centrifugar otra vez y eliminar el sobrenadante.
Agregar Fijador Carnoy frio, sin agitar y dejando la muestra a 4°C por 30 minutos.Agitar, centrifugar, eliminar sobrenadante y añadir nuevamente fijador (se realizaron 2 lavados).
Chequear al microscopio de contraste de fases la calidad y concentración de las placas metafásicas por campo luego de gotearlas sobre un portaobjetos.
Resuspender y homogenizar en volumen de fijador adecuado a la concentración de placas metafásicas
Confeccionar las preparaciones dejando caer una gotade muestra sobre un portaobjetos a una distancia de aproximadamente 30 cm.

Fundamentos
-Phytohemoaglutinina: estimulador de la mitosis de linfocitos, inducirá la entrada de los éstas células en etapa G0 del ciclo celular al ciclo proliferativo. Da un crecimiento óptimo de linfocitos a las 72 horas luego de aplicarlo.
-Colchisina (colcemid): inhibidor de la formación de microtúbulos polares...