Giberalinas

INTRODUCCION:
Las giberelinas son una familia de fitohormonas diterpénicas, relacionadas con el núcleo de los ent-giberelano, ampliamente distribuídas en plantas y presentes en algunos hongos. Estas fitohormonas regulan el crecimiento y desarrollo vegetal de semillas y frutos y se encuentran en pequeñas cantidades en las plantas constituyendo un complejo y creciente grupo de productosnaturales. Debido al rol fundamental como reguladores del desarrollo vegetal presentan interés en aplicaciones agronómicas. Las giberelinas biológicamente activas son aquellas lactónicas (19,10- g -lactona), como es el caso de GA3, GA4 y GA7. Estas giberelinas se obtienen a partir de la fermentación del hongo filamentoso Gibberella fujikuroi, microorganismo que se caracteriza por la producción degiberelinas a niveles de concentración mucho mayores a los encontrados en plantas.
Los estudios biosintéticos relacionados con estas moléculas en sistemas vegetales requieren disponer de estándares de giberelinas para la identificación cromatográfica de los productos generados.
De las seis giberelinas lactónicas potencialmente bioactivas, descritas en sistemas vegetales se dispone comercialmente, encantidades apreciables y costos razonables sólo de GA3. En el presente trabajo se propone una metodología para separar, aislar y caracterizar algunas giberelinas lactónicas, producidas por el hongoGibberella fujikuroi con el fin de obtener estándares que permitan identificar cromatográficamente estos compuestos.






PARTE EXPERIMENTAL
a.- Preparación del medio de cultivo
El medio de cultivode Gibberella fujikuroi se obtuvo a partir de la cepa nativa ACC 917 (Imperial Chemical Industries) conservada en agar papa dextrosa (PDA) a 28°C, utilizado como inóculo para los cultivos líquidos. El cultivo líquido (ICI) se efectuó según Geissman5 conservando el porcentaje de nitrato de amonio en el medio de 10%. El medio líquido al 10% está compuesto por: glucosa 80 g/L; MnSO4 x 7H2O 1 g/L;NH4NO3 0.48 g/L; 2 mL de una solución de elementos traza (FeSO4 x 7H2O 0.1 g; CuSO4 x H2O 0.015 g; ZnSO4 x 7H2O 0.161 g; MnSO4 x 7H2O 0.01 g (NH4)6Mo7O24 x 24H2O 0.01 g; disueltos en 100 mL de H2O desionizada). Los cultivos se mantuvieron a 28°C en un agitador orbital a 120 rpm por 7-8 días.
b.- Extracción de giberelinas desde el medio de cultivo
Se filtraron al vacío 1.5 L del cultivo obtenido.El filtrado se acidificó hasta pH 3.0 y se extrajeron las giberelinas por partición con acetato de etilo (3 x 300 mL). El rendimiento de la extracción es de 95%. Las fracciones orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida y posteriormente se analizaron por CCF en sílica gel 60 H, utilizando como mezclas eluyentes éter de petróleo:acetato de etilo 60:40 (sistema 1) y diclorometano:acetatode etilo:ácido acético 90:10:1 (sistema 2). Como sistema 3 se empleó la mezcla éter de petróleo: acetato de etilo 30:70. Las placas se revelaron con el reactivo de Liebermann y se observaron a la luz UV (254 y 360 nm).
c.- Fraccionamiento de giberelinas
El crudo de giberelinas (600 mg) se fraccionó mediante sucesivas columnas flash en sílica gel 60 H. En la primera de estas columnas se impregnóel soporte con ácido fórmico 0.5 M (columna 1) y se eluyó con mezclas de polaridad creciente de éter de petróleo/acetato de etilo, saturadas con ácido fórmico 0.5 M. Cada fracción obtenida desde esta columna fue cromatografiada posteriormente en sucesivas columnas de sílica gel 60 H (columnas 2 y 3), utilizando como eluyentes los sistema 1 y 2, respectivamente. Las fracciones que contenían lasgiberelinas de interés se sometieron a cromatografía preparativa en placas de sílica gel 60 (cromatofolios de Al de 20 x 20 cm y 0.25 mm de espesor), empleando como eluyentes los sistemas 1 y 2.
d.- Preparación de derivados metilados
Los eluídos de giberelinas parcialmente purificadas provenientes de las placas preparativas, se llevaron a sequedad y se metilaron con diazometano etéreo.
e.-...