Glucidos

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEINAS

PRACTICA No.7 y 8

JENNY PATRICIA VILLARRAGA ORTIZ
2 LACC
ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS
IES. FUENTESNUEVAS

OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN

Mediante esta práctica pretendemos, cuantificar la concentración de una disolución de proteína por de los métodos colorimétricos más en uso: Biuret y Lowry. Establecer los rangos de aplicación de cada uno de losmétodos, así como sus límites de detección y comparar las sensibilidades de cada uno de los métodos respecto a la concentración de proteína a determinar.

REFERENCIA A LA NORMA

Apuntes o instrucciones entregadas por el profesor del módulo de Ensayos Biotecnilógicos.

DEFINICIONES

COLORIMETRO: Un colorímetro es cualquier herramienta que identifica el color y el matiz para unamedida más objetiva del color.

ESPECTROFOTOMETRO: es un instrumento usado en el análisis químico que sirve para medir, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones y la concentración o reacciones químicas que se miden en una muestra. También es utilizado en los laboratorios de química para la cuantificaciónde sustancias y microorganismos.

ABSORBANCIA (Abs): es un concepto más relacionado con la muestra puesto que nos indica la cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T, en consecuencia: A = log 1/T = -log T = -log It/ Io.
Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales (Io = It), latransmitancia es del 100% e indica que la muestra no absorbe a unadeterminada longitud de onda, y entonces A vale log 1 = 0.

RECTA DE CALIBRADO: es un método de química analítica empleado para medir la concentración de una sustancia en una muestra por comparación con una serie de elementos de concentración conocida. Se basa en la existencia de una relación en principio lineal entre un carácter medible (por ejemplo la absorbancia en los enfoques deespectrofotometría) y la variable a determinar (la concentración).


FUNDAMENTOS

Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocassustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero)


reacción de Biuret

METODO DE BIURET
El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la condensación de dos moléculas de urea con eliminación de amoníaco.
Si una solución fuertemente alcalina desulfato cúprico (CuSO4) se añade a una solución de proteína se forma una complejo entre el ion cúprico y los enlaces peptídicos, con aparición de una coloración violeta-púrpura, que presenta un máximo de absorción a 540 nm.
Las características más importantes de la reacción son:
· La reacción del Biuret se aplica, a partir de los tetrapéptidos, a todos los péptidos y proteínas.
· Su rango dedeterminación es de 1 a 6 mg/ml.
· No depende de la composición de aminoácidos.
· Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) dan la reacción.

METODO DE LOWRY
La determinación cuantitativa de la concentración de proteínas es una de las pruebas que mas frecuentemente deben hacerse en el laboratorio de bioquímica. Primitivamente, la cantidad de proteínas se evaluaba midiendo la cantidad total de nitrógenoproteico, y teniendo en cuenta que este elemento representa aproximadamente el 16% del peso de una proteína. Este era un método largo y laborioso y con poca sensibilidad. La aparición de métodos calorimétricos ha permitido solventar estos dos inconvenientes.
Entre los métodos calorimétricos destacan tres: el método de Biuret, el método de Lowry y el método de Azul de Coomasie. En esta...