glut 4 e insulina





ESTUDIO DE LAS MODIFICACIONES OXIDATIVAS DE LA LIPOPROTEÍNA DE BAJA DENSIDAD (LDL):
ANALISIS DE LA OXIDACIÓN DEL COMPONENTE LIPÍDICO Y PROTEICO.










Integrantes: Br. Allío, Natalia.
Br. Castro, Stefanie.Br. Álvarez, Lucía.
Grupo H2 C4.
OBJETIVOS

Estudiar la oxidación de la LDL por Cu (II) utilizando diferentes metodologías experimentales, analizando las modificaciones sufridas por los tres principales componentes de la lipoproteína: lípidos, apolipoproteína B- 100 y antioxidantes.


MATERIALES

Paradosificación de la concentración de LDL

LDL purificada
Reactivo de Biuret
Solución estándar de proteínas
Buffer fosfato
Pipetas
Espectrofotómetro

Para Oxidación lipídica- Consumo de oxígeno

Oxímetro
Cámara de 4 ml de vol. final.
LDL purificada
Buffer fosfato 50 mM, pH 7,4
CuSO4
Pipetas
Tubo Falcon

Para Oxidación de carotenoides

LDL purificada
CuSO4
EspectrofotómetroPipetas

Para Oxidación de LDL- Electroforesis en agarosa

Gel de agarosa al 0,5% en buffer Tris-Glicina
Buffer de muestra 5x
Buffer corrida (Tris-Glicina)
Solución de fijación (etanol:ácido acético:H2O)
Solución de tinción (Coomasie Brillant Blue R-250)
Solución de Destain (MeOH:acético:H2O)
LDL purificada
CuSO4
Pipetas
Papel de filtro.

















PROCEDIMIENTOPara la realización de este práctico se utilizó LDL purificada a partir de plasma humano mediante ultracentrifugación.

La dosificación de la concentración de la LDL fue realizada mediante la reacción de Biuret de manera espectrofotométrica. (El reactivo de Biuret ya fue provisto). En primera instancia se realizó una curva de calibración en el rango de 1 mg/ml a 10 mg/ml a partir de unaconcentración proteica conocida (BSA). Calculamos la pendiente de dicha gráfica, obteniendo el valor de épsilon. La tabla con los valores obtenidos, la gráfica, así como el cálculo de épsilon se muestran más adelante.

Para la determinación de la concentración de la LDL por espectrofotometría se preparó una gradilla con 23 tubos correspondientes a 18 tubos (tres por cada concentración) para la curvade calibración, 1 tubo blanco de reacción (Buffer fosfato), 4 tubos para la mezcla problema (dos diluciones diferentes por duplicado). Para permitir el desarrollo de color del método de Biuret se colocó en cada tubo 0,2 ml de solución proteica y 0,8 ml de reactivo de Biuret y se dejó reaccionar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se midió la absorbancia de cada mezcla dereacción a 540 nm. De esta manera es posible hallar la concentración de LDL de la solución problema considerando que épsilon fue obtenida de la curva de calibración.

Por otra parte, la oxidación lipídica de la LDL fueron analizados por consumo de oxígeno y espectrofotometría (consumo de antioxidantes) mientras que las modificaciones en la apolipoproteína B-100 fueron analizadas por electroforesis.El consumo de oxígeno se realizó en una cámara de 4 ml de volumen final a agitación constante. Antes de prodecer a evaluar el comportamiento de la solución de problema frente a la oxidación de la LDL fue necesario calibrar el oxímetro. Para ello se burbujeó con pipeta pasteur durante algunos minutos para saturar con aire la cámara que contenía agua solamente. Posteriormente se esperó a que seestabilizara la medida y se llevó a 100% con la perilla CAL. Una vez calibrado el equipo, fue posible empezar a trabajar. Se incubó, en un volumen final de 4 ml, la LDL (0,1 mg/ml, concentración final) en buffer fosfato 50 mM, pH 7,4 con CuSO4 en una relación LDL/Cu(II) de 1:150. Con dichos datos era necesario conocer la cantidad de LDL y Cu(II) que se debían hacer reaccionar. Sabíamos que el...