Guía de laboratorio
Páginas: 6 (1337 palabras)
Publicado: 6 de octubre de 2014
Laboratorio de Biología Molecular
Prácticas 3 a 5
Extracción de Proteínas, Visualización en Gel de Poliacrilamida y Tinción
Introducción
La proteómica que comprende el estudio del proteoma (totalidad de las proteínas codificadas por un genoma) de un organismo, requiere de técnicas empleadas para la extracción y separación de todas o determinadas proteínas producidas por un organismodurante su ciclo vital.
La extracción y purificación de las proteínas producidas por una célula o un tejido es un proceso de gran importancia debido a que a partir de este procedimiento se puede proseguir con otros procesos como son la caracterización estructural y funcional de las mismas.
Se han descrito diferentes métodos para la extracción y purificación de proteínas:
Métodoscromatográficos
Diferenciación por solubilidad
Precipitación proteica con sales
Métodos de determinación de concentración proteica (Ensayo Bradford de proteínas)
Electroforesis bajo condiciones denaturantes y no denaturantes
La electroforesis en gel puede dar información sobre el peso molecular, la carga, las subestructuras de las proteínas, el grado de pureza de determinadas preparaciones de proteínas.Bajo éste método es posible separar proteínas que difieren en pocos cientos de Dalton ó en menos de 0.1 unidades de pH en su punto isoeléctrico.
La electroforesis en gel comprende muchas técnicas, entre ellas el método SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis), el cual permite estimar el número de polipéptidos en una muestra, así como comparar el contenido proteicode muestras de diferente origen. Esta técnica requiere que las proteínas sean denaturadas para poder ofrecer información sobre el peso molecular de las proteínas, la única variable que influirá en la movilidad electroforética (tasa de la migración de una proteína por unidad de fuerza del campo eléctrico aplicado) de las proteínas que migran por el gel de esta electroforesis.
Objetivos.Comprender los principios involucrados en el proceso de extracción de proteínas.
Realizar la extracción y purificación de proteínas a partir de diferentes especies de bacterias.
Comprender el principio de separación de proteínas bajo el método de electroforesis vertical.
Visualizar exitosamente las proteínas extraídas en gel de poliacrilamida.
PRÁCTICA 3
Extracción de proteínas bacterianasa) La bacteria se crece ON (Over Night) en caldo LB a una agitación de 250 rpm.
b) Marcar eppendorf con cada uno de los nombres de las cepas a trabajar
c) Medir 1 ml de medio de cultivo y añadirlo al eppendorf correspondiente.
d) Centrifugar por 5 min a 13000 rpm.
e) Descartar 800 ul de sobrenadante en hipoclorito diluído.
f) Realizar vortex para resuspender.
g) Agregar la mitad del volumende Buffer de muestra (que debía estar en baño de maría), es decir si tiene 200ul de muestra agregar 100ul de Buffer de muestra. Observar pellet, si esta muy mocoso, agregar 20ul mas de Buffer de muestra.
h) Colocar las muestras en la plancha térmica a 100ºC (hacer perforaciones a las tapas de los tubos eppendorf) por 5 minutos.
i) Centrifugar 13000 rpm por 5 minutos.
j) En el sobrenadanteestán las proteínas. (quitar el “moco”).
PRÁCTICA 4
Electroforesis en geles de poliacrilamida
Preparación del gel de separación
Para separar proteínas de 60 a 200 kDa use un gel del 5%, para proteínas de 16 a 70 kDa use uno de 10% y uno de 15% para separar proteínas de 12 a 45 kDa.
a) Preparar una solución de persulfato de amonio (fresca diariamente) al 10 % (50 mg en 0.5 ml H2O o 25 mg en0.25 ml H2O).
b) Mida 1 cm por debajo de los peines en el montaje, hasta este punto llenará así es que márquelo.
c) En un beaker de 50 ml mezcle 2ml de solución de poliacrilamida
1,25ml de solución pH 8.8
1,75 ml de H2O
Adicione 50 ul de Persulfato de Amonio al 10% preparado en fresco y 8 ul de TEMED. Agite gentilmente para mezclar y use de inmediato.
d) Al haber alcanzado el nivel...
Prácticas 3 a 5
Extracción de Proteínas, Visualización en Gel de Poliacrilamida y Tinción
Introducción
La proteómica que comprende el estudio del proteoma (totalidad de las proteínas codificadas por un genoma) de un organismo, requiere de técnicas empleadas para la extracción y separación de todas o determinadas proteínas producidas por un organismodurante su ciclo vital.
La extracción y purificación de las proteínas producidas por una célula o un tejido es un proceso de gran importancia debido a que a partir de este procedimiento se puede proseguir con otros procesos como son la caracterización estructural y funcional de las mismas.
Se han descrito diferentes métodos para la extracción y purificación de proteínas:
Métodoscromatográficos
Diferenciación por solubilidad
Precipitación proteica con sales
Métodos de determinación de concentración proteica (Ensayo Bradford de proteínas)
Electroforesis bajo condiciones denaturantes y no denaturantes
La electroforesis en gel puede dar información sobre el peso molecular, la carga, las subestructuras de las proteínas, el grado de pureza de determinadas preparaciones de proteínas.Bajo éste método es posible separar proteínas que difieren en pocos cientos de Dalton ó en menos de 0.1 unidades de pH en su punto isoeléctrico.
La electroforesis en gel comprende muchas técnicas, entre ellas el método SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis), el cual permite estimar el número de polipéptidos en una muestra, así como comparar el contenido proteicode muestras de diferente origen. Esta técnica requiere que las proteínas sean denaturadas para poder ofrecer información sobre el peso molecular de las proteínas, la única variable que influirá en la movilidad electroforética (tasa de la migración de una proteína por unidad de fuerza del campo eléctrico aplicado) de las proteínas que migran por el gel de esta electroforesis.
Objetivos.Comprender los principios involucrados en el proceso de extracción de proteínas.
Realizar la extracción y purificación de proteínas a partir de diferentes especies de bacterias.
Comprender el principio de separación de proteínas bajo el método de electroforesis vertical.
Visualizar exitosamente las proteínas extraídas en gel de poliacrilamida.
PRÁCTICA 3
Extracción de proteínas bacterianasa) La bacteria se crece ON (Over Night) en caldo LB a una agitación de 250 rpm.
b) Marcar eppendorf con cada uno de los nombres de las cepas a trabajar
c) Medir 1 ml de medio de cultivo y añadirlo al eppendorf correspondiente.
d) Centrifugar por 5 min a 13000 rpm.
e) Descartar 800 ul de sobrenadante en hipoclorito diluído.
f) Realizar vortex para resuspender.
g) Agregar la mitad del volumende Buffer de muestra (que debía estar en baño de maría), es decir si tiene 200ul de muestra agregar 100ul de Buffer de muestra. Observar pellet, si esta muy mocoso, agregar 20ul mas de Buffer de muestra.
h) Colocar las muestras en la plancha térmica a 100ºC (hacer perforaciones a las tapas de los tubos eppendorf) por 5 minutos.
i) Centrifugar 13000 rpm por 5 minutos.
j) En el sobrenadanteestán las proteínas. (quitar el “moco”).
PRÁCTICA 4
Electroforesis en geles de poliacrilamida
Preparación del gel de separación
Para separar proteínas de 60 a 200 kDa use un gel del 5%, para proteínas de 16 a 70 kDa use uno de 10% y uno de 15% para separar proteínas de 12 a 45 kDa.
a) Preparar una solución de persulfato de amonio (fresca diariamente) al 10 % (50 mg en 0.5 ml H2O o 25 mg en0.25 ml H2O).
b) Mida 1 cm por debajo de los peines en el montaje, hasta este punto llenará así es que márquelo.
c) En un beaker de 50 ml mezcle 2ml de solución de poliacrilamida
1,25ml de solución pH 8.8
1,75 ml de H2O
Adicione 50 ul de Persulfato de Amonio al 10% preparado en fresco y 8 ul de TEMED. Agite gentilmente para mezclar y use de inmediato.
d) Al haber alcanzado el nivel...
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