Guía de proteínas

Ensayos colorimétricos Los ensayos más usados son los de Biuret, de Bradford, de Lowry y el ensayo usando ácido bicinconínico. En el presente práctico utilizaremos los ensayos de Biuret y de Bradford. El ensayo de Lowry es de sensibilidad algo menor al de Bradford (0,025 - 0,5 mg/ml), es más confiable, pero es más complicado.

ODON0007 DETERMINACION DE PROTEINAS
INTRODUCCION: Se han descritomuchos métodos diferentes para la determinación cuantitativa de proteínas. Estos métodos difieren entre si en sensibilidad, existencia de interferencias, exactitud y sencillez. La selección del método adecuado se realiza considerando las características de las muestras que se desean analizar, que pueden ser extractos de tejidos animales o vegetales, líquidos biológicos de interés en bioquímicaclínica (suero, orina), muestras obtenidas en el curso de la purificación de una proteína, fracciones de una columna cromatográfica, muestras de una proteína pura, etc. En general los métodos utilizados para la determinación cuantitativa de proteínas consisten en la determinación absorciométrica directa o en ensayos de tipo colorimétrico, turbidimétrico o fluorométrico. Absorciometría de proteínas Lamayoría de las proteínas presentan un máximo de absorbancia a 280 nm aproximadamente, debido principalmente a la presencia de residuos de triptófano y tirosina, y en mucho menor proporción, de fenilalanina. Los residuos de histidina, cisteína y cistina también presentan bandas de absorbancia en el ultravioleta cercano, pero se encuentran a menores longitudes de onda y son de menor intensidad. Laposición exacta del máximo de absorbancia, así como el coeficiente de extinción molar de una proteína depende de su composición aminoacídica. Por consiguiente, solamente para soluciones de una proteína pura, conocida, cuyo coeficiente de extinción se ha determinado previamente, se puede calcular la concentración a partir de su absorbancia. Se han efectuado estimaciones de la concentración total deproteínas en mezcla a partir de la absorbancia a 280 nm (A 280) o usando la razón A 280/A 260 (método de Warburg), que permite corregir el error debido a la contaminación por ácidos nucleicos, los que presentan un máximo de absorbancia a 260 nm. Las proteínas también absorben fuertemente a longitudes de onda menores a 240 nm, debido principalmente a la contribución de los residuos de aminoácidosaromáticos, así como de los enlaces peptídicos (bajo los 220 nm). La literatura describe métodos para efectuar estimaciones de concentración utilizando la absorbancia en esta región. Sin embargo, todas estas estimaciones pueden llevar a un error considerable debido a la presencia de contaminantes o a una composición aminoacídica atípica.

Cuantificacion de proteínas por el método de Biuret Elreactivo de Biuret (sulfato cúprico en medio alcalino), reacciona con compuestos que contienen dos o más enlaces peptídicos dando una coloración violeta. El color desarrollado se debe a un complejo de coordinación entre el Cu++ y cuatro átomos de nitrógeno que provienen de dos cadenas peptídicas. El método de Biuret sirve para la determinación de concentraciones entre 1 y 10 mg/ml. Los dipéptidos ylos aminoácidos (excepto serina y treonina) no dan esta reacción. Interferencias: Péptidos, Tris, sacarosa y pigmentos biliares también generan el color, sales de amonio y sacarosa afectan el color.

PARTE EXPERIMENTAL
1. ENSAYO DE BIURET MATERIALES Reactivo de Biuret: Preparación: Colocar 1.5 g de sulfato de cobre (CuSO4 X 5 H2O) y 6 g de tartrato de sodio y potasio (NaKC4H4O6 x 4 H2O)en un vasode 1000 ml. Agregar alrededor de 500 ml de agua destilada y agitar hasta disolución. Agregar lentamente y agitando constantemente, 300 ml de hidróxido de sodio 2.5 N. Las dos soluciones deben estar a temperatura ambiente. Agregar 1.0 g de ioduro de potasio y agitar hasta que esté totalmente disuelto. Diluir a 1000 ml y guardar en frasco de polietileno. Este reactivo es estable indefinidamente....