Guía N2 Electroforesis Horizontal 1
Páginas: 5 (1228 palabras)
Publicado: 8 de octubre de 2015
FACULTAD DE SALUD
TECNOLOGÍA MÉDICA
GENÉTICA
Guía del práctico “Electroforesis horizontal”
“Electroforesis de ácidos nucleicos en gel de agarosa”
La electroforesis en gel de agarosa es un método que se utiliza para separar macromoléculas en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas. El término electroforesis describe la migración de las partículas cargadas bajo lainfluencia de un campo eléctrico. “Electro” se refiere a la electricidad y “foresis”, del griego phoros, significa “trasladar”.
La fuerza motriz de la electroforesis es la tensión eléctrica aplicada a los electrodos en ambos extremos del gel. La separación de las macromoléculas depende de dos variables: carga y masa. Cuando una muestra biológica, como por ejemplo el ADN, se mezcla en una solucióntampón y se aplica a un gel, esas dos variables actúan conjuntamente (1). La corriente eléctrica de un electrodo repele las moléculas, al tiempo que el otro electrodo las atrae. Así, porejemplo, cuando se aplica un campo eléctrico a un gel con pH neutro, los grupos fosfato del ADN cargados negativamente lo harán migrar hacia el ánodo(2)+. La electroforesis en gel de agarosa es un métodonormalizado sencillo y rápido que se utiliza para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. El ADN puede visualizarse en el gel tiñendo el mismo con una concentración baja de un colorante como bromuro de etidio u otro que actúen como intercalantes fluorescentes.
Componentes de la electroforesis en gel de agarosa:
Agarosa:
La agarosa, es un polisacárido lineal (con un peso molecular medio de~12 000 Da) formado por la repetición de la unidad básica, la agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6- anhidrogalactosa. Los geles de agarosa permiten una electroforesis rápida, pero con una resolución limitada por cuanto las bandas que se forman en los geles tienen tendencia a ser difusas y a esparcirse. Ello obedece al tamaño de los poros y no puede controlarse.En funciónde la concentración de agarosa o tampón, se pueden separar segmentos de ADN que contengan de 20 a 50.000 pb. En los geles horizontales, la agarosa se emplea por lo general en concentraciones comprendidas entre un 0,7 % y un 3 % (ver tabla I).
Tabla I: Concentración recomendada de gel de agarosa para separar moléculas de ADN lineales.
Tampón de electroforesis:
La movilidad electroforética delADN se ve afectada por la composición y la fuerza iónica del tampón de electroforesis. En ausencia de iones, la conductancia eléctrica es mínima y el ADN migra lentamente o ni siquiera se desplaza. En un tampón de elevada fuerza iónica la conductancia eléctrica es muy elevada y se genera una importante cantidad de calor. En el peor de los casos, el gel se funde y el ADN se desnaturaliza.
Se disponede varios tipos de tampones para la electroforesis de ADN nativo bicatenario. Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE), tris-borato (TBE) o trisfosfato(TPE) a una concentración de aproximadamente 50 mM (pH 7,5 – 7,8).
Marcador de peso molecular:
La distancia de migración del ADN depende del peso molecular del material inicial. Así pues, debe cargarse un marcador de ADN que contieneun númerodeterminado de segmentos de ADN conocidos, lo cual facilita la labor de determinar el tamaño de los ADN desconocidos.
Tampón de carga:
Las muestras de ADN que deben cargarse en el gel de agarosa se mezclan en primer lugar con un tampón de carga que por lo general contiene agua, sacarosa y un colorante (por ejemplo, cianol de xileno, azul de bromofenol, verde de bromocresol, etc.). El tampón decarga se emplea con tres fines:
1. Aumentar la densidad de las muestras para que las gotas de ADN caigan uniformemente en el pocillo.
2. Añadir color a la muestra, simplificando de este modo el proceso de carga.
3. Incorporar un colorante a la muestra que, en un campo eléctrico, se desplace hacia el ánodo a una velocidad previsible.
Objetivo general del práctico:
Evaluar la integridad y tamaño...
TECNOLOGÍA MÉDICA
GENÉTICA
Guía del práctico “Electroforesis horizontal”
“Electroforesis de ácidos nucleicos en gel de agarosa”
La electroforesis en gel de agarosa es un método que se utiliza para separar macromoléculas en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas. El término electroforesis describe la migración de las partículas cargadas bajo lainfluencia de un campo eléctrico. “Electro” se refiere a la electricidad y “foresis”, del griego phoros, significa “trasladar”.
La fuerza motriz de la electroforesis es la tensión eléctrica aplicada a los electrodos en ambos extremos del gel. La separación de las macromoléculas depende de dos variables: carga y masa. Cuando una muestra biológica, como por ejemplo el ADN, se mezcla en una solucióntampón y se aplica a un gel, esas dos variables actúan conjuntamente (1). La corriente eléctrica de un electrodo repele las moléculas, al tiempo que el otro electrodo las atrae. Así, porejemplo, cuando se aplica un campo eléctrico a un gel con pH neutro, los grupos fosfato del ADN cargados negativamente lo harán migrar hacia el ánodo(2)+. La electroforesis en gel de agarosa es un métodonormalizado sencillo y rápido que se utiliza para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. El ADN puede visualizarse en el gel tiñendo el mismo con una concentración baja de un colorante como bromuro de etidio u otro que actúen como intercalantes fluorescentes.
Componentes de la electroforesis en gel de agarosa:
Agarosa:
La agarosa, es un polisacárido lineal (con un peso molecular medio de~12 000 Da) formado por la repetición de la unidad básica, la agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6- anhidrogalactosa. Los geles de agarosa permiten una electroforesis rápida, pero con una resolución limitada por cuanto las bandas que se forman en los geles tienen tendencia a ser difusas y a esparcirse. Ello obedece al tamaño de los poros y no puede controlarse.En funciónde la concentración de agarosa o tampón, se pueden separar segmentos de ADN que contengan de 20 a 50.000 pb. En los geles horizontales, la agarosa se emplea por lo general en concentraciones comprendidas entre un 0,7 % y un 3 % (ver tabla I).
Tabla I: Concentración recomendada de gel de agarosa para separar moléculas de ADN lineales.
Tampón de electroforesis:
La movilidad electroforética delADN se ve afectada por la composición y la fuerza iónica del tampón de electroforesis. En ausencia de iones, la conductancia eléctrica es mínima y el ADN migra lentamente o ni siquiera se desplaza. En un tampón de elevada fuerza iónica la conductancia eléctrica es muy elevada y se genera una importante cantidad de calor. En el peor de los casos, el gel se funde y el ADN se desnaturaliza.
Se disponede varios tipos de tampones para la electroforesis de ADN nativo bicatenario. Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE), tris-borato (TBE) o trisfosfato(TPE) a una concentración de aproximadamente 50 mM (pH 7,5 – 7,8).
Marcador de peso molecular:
La distancia de migración del ADN depende del peso molecular del material inicial. Así pues, debe cargarse un marcador de ADN que contieneun númerodeterminado de segmentos de ADN conocidos, lo cual facilita la labor de determinar el tamaño de los ADN desconocidos.
Tampón de carga:
Las muestras de ADN que deben cargarse en el gel de agarosa se mezclan en primer lugar con un tampón de carga que por lo general contiene agua, sacarosa y un colorante (por ejemplo, cianol de xileno, azul de bromofenol, verde de bromocresol, etc.). El tampón decarga se emplea con tres fines:
1. Aumentar la densidad de las muestras para que las gotas de ADN caigan uniformemente en el pocillo.
2. Añadir color a la muestra, simplificando de este modo el proceso de carga.
3. Incorporar un colorante a la muestra que, en un campo eléctrico, se desplace hacia el ánodo a una velocidad previsible.
Objetivo general del práctico:
Evaluar la integridad y tamaño...
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