Gu A 1







LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 502507
GUÍA 1. Desnaturalización de proteínas y reconocimiento de aminoácidos

I. EL PROBLEMA.

Identificar los diferentes factores que afectan la estabilidad de las proteínas y reconocer algunas de las pruebas más comunes en la identificación de aminoácidos.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE AMINOÁCIDOS

Reacción Xantoproteica
Losanillos aromáticos presentes en algunos aminoácidos reaccionan con ácido nítrico concentrado formando nitroderivados de color amarillo o anaranjado por lo cual esta reacción permite reconocer la presencia de tirosina y triptófano.

Reacción de Hopkins Cole
El anillo indólico presente en la cadena lateral de los alfa-aminoácidos libres o haciendo parte de péptidos y proteínas se puede reconocer mediantereacción con el ácido glioxílico a pH ácido, puesto que forma complejos de coloración violeta o amarillo violeta, permitiendo así identificar al triptófano.

Reacción con acetato de plomo alcalino
Los aminoácidos azufrados como la cisteína se reconocen por la formación de precipitados de Sulfuro de Plomo de color gris oscuro o negro que se forman cuando reacciona con Acetato de Plomo en medioalcalino.

Reacción de Ninhidrina
La ninhidrina reacciona con los α- L- aminoácidos libres a un pH entre 4 y 8, formando CO2, NH3 y un aldehído. El amoniaco producido en la reacción se combina con una molécula de ninhidrina reducida y otra en forma oxidada, formando un compuesto de color azul. Los aminoácidos prolina (P) e hidroxiprolina también reaccionan con la ninhidrina, pero en este caso, seobtiene un color amarillo en vez del azul característico.

DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS

La desnaturalización consiste en el desdoblamiento total o parcial de la conformación nativa de una cadena polipeptídica o una proteína. Consiste en romper las fuerzas que estabilizan la estructura secundaria, es decir, los puentes de hidrógeno entre enlaces peptídicos y/o terciaria ocuaternaria, como las fuerzas esquematizadas en la figura 1.

















Las proteínas tal como están dentro de las células o en los fluidos corporales, tienen una conformación nativa y se encuentran solubilizadas en soluciones coloidales o suspensiones coloidales, si se producen ciertas alteraciones en las condiciones del medio acuso se desdoblan pierden solubilidad y precipitan o coagulan.Diversos agentes desnaturalizantes pueden inducir estas alteraciones como la agitación, el cambio de temperatura, la adición de sustancias ácidas o básicas, sales, metales pesados, reactivos con grupos tiol, solventes orgánicos, etc.

III. MATERIALES Y REACTIVOS.

Material por grupo 2 Gradillas
20 Tubos de ensayo 1 Propipeta
2 Pipetas graduadas de 5 mL 1 Pinza para tubo de ensayo
2Probetas de 10 mL 1 Espátula
5 Goteros

Material y reactivos generales (volúmenes calculados para diez grupos de laboratorio)

Acido clorhídrico 1N (200 mL) Solución de acetato de plomo 0,1M
Sulfato de amonio al 25%(200 mL) Acido nítrico concentrado (100 mL)
Etanol 96% Hidróxido de sodio 40% (100 mL)
Sulfato de cobre 0,1M ( 500 mL) Acido sulfúrico concentrado (100 mL)
Hidróxido de sodio 20%(300 mL) Hielo
Reactivo de Biuret Reactivo de ninhidrina
Soluciones de prolina y serina 1g/L

Reactivo de Hopkins cole (FRESCO): ácido acético impurificado con trazas de ácido glioxílico(100mL)

Nota: el profesor escogerá una muestra para cada una de las pruebas e informará a los estudiantes con anterioridad el nombre de esta para poder elaborar el correspondiente preinforme.

IV.PROCEDIMIENTO

PROCEDIMIENTOS DE DESNATURALIZACIÓN.

1. Desnaturalización térmica

Colocar en un tubo de ensayo 3 mL de la solución acuosa de la muestra, calentar al baño maría y observar si se presenta algún cambio.

2. Desnaturalización por pH extremo

Colocar en un tubo de ensayo 3 mL de solución acuosa de la muestra, adicionar 0,5 mL de ácido clorhídrico 1N y observar.

3. Precipitación...