Gui N De Pr Cticas Expresi N G Nica
EXPRESIÓN GÉNICA Y SU REGULACIÓN
PRÁCTICAS
BIOQUÍMICA 2º CURSO
CURSO 2014‐15
Prácticas
Parte I; Biología Molecular Básica
Práctica 1. Transformación de E. coli con DNA plasmídico.
Práctica 2. Determinación cuantitativa, titulación, de una dilución de
bacteriófagos.
Parte II; Control de la expresión génica en bacterias
Práctica 3. Control negativo: el operón lactosa.
Práctica 4. Control positivo: represión catabólica por glucosa en el
operón arabinosa.
Práctica 5. Utilización del operón lactosa en un sistema de expresión
heteróloga de proteínas en bacterias.
Parte III; Mutación y reparación
Práctica 6. Determinación de la viabilidad celular tras la exposición a
rayos UV.
Práctica 7. Mutagénesis mediante el uso de transposones.
Cada grupo de trabajo deberáentregar al finalizar la semana de prácticas un
cuaderno de prácticas.Este cuaderno deberá contener una breve descripción
del objetivo y procedimiento de cada práctica junto con los resultados obtenidos
en cada una ellas así como las a las cuestiones que propuestas al final de cada
una de ellas.
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Práctica 1. Transformación de E. coli con DNA plasmídico
La transformación bacteriana es el proceso por el que un DNA exógeno es introducido en el interior de una
bacteria, si esta molécula de DNA es circular y tiene un origen de replicación podrá replicarse en la bacteria y se podrá
obtener una gran cantidad de moléculas del DNA introducido en la misma.
Si, además, la molécula de DNA proporciona alguna característica nueva a la bacteria donde se ha introducido,
podremos utilizarla esta característica para seleccionar la bacteria que contiene esa molécula de DNA. La característica más
usada en para su selección es la adquisición de resistencia a antibióticos, esta viene determinada por la presencia en los
plásmidos de genes que codifican para proteínas capaces de degradar los antibióticos.
Vamos a realizar la transformación de tres plásmidos problema, A, B y C que contienen genes que confieren a las
bacterias resistencia frente diferentes tipos de antibiótico. Se utilizarán plásmidos conteniendo los genes que proporcionan
resistencia a los antibióticos ampicilina y kanamicina. Figura 1. Esquema de un plásmido circular de clonaje estándar. Sobre el plásmido se indican sus componentes; un origen de replicación
bacteriano (ori), genes de resistencia a los antibióticos ampicilina ‐Ap‐ y Kanamicina ‐Kan‐, el gen para el enzima beta‐galactosidasa
bacteriana (lacz) y una región con dianas de restricción únicas que permiten insertar el fragmento de DNA de interés para la obtención de
moléculas recombinantes de DNA.
Materiales;
Medio de cultivo LB (Luria‐Bertani) líquido sin antibiótico (por litro contiene: Extracto de levadura, 5g;
Bactotriptona; 10g; ClNa 10g; a pH 7.5).
Placas petri con medio de cultivo LB sólido (al medio LB líquido se le añade 15g/L de agar). Serán placas
sin antibiótico y con antibiótico. Se van a utilizar placas con los antibióticos ampicilina 50 g/ml y
kanamicina 25 g/ml.
Alícuotas de bacterias competentes para la transformación. Se va a utilizar la cepa XL1blue que se ha
tratado con Cl2Ca 0.1 M. Se piensa que el tratamiento con cationes, sirven calcio, rubidio o litio, de
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cultivos bacterianos en fase de crecimiento exponencial facilita la entrada de DNA exógeno en la bacteria.
Las bacterias tratadas con calcio se mantienen a bajas temperaturas hasta su utilización.
DNA deplásmidos a una concentración de 10 ng/l.
Se necesitará etanol para la esterilización de las asas de siembra, así como mechero y baños a diferentes
temperaturas. Puntas para pipetas automáticas y tubos eppendorf esterilizados.
Procedimiento;
Todo el material que se requiere para la utilización de esta práctica debe ser estéril y debe ser manejado cerca
de la llama del...
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