Guia 7 QA Principios de cromatografía

Facultad de Ciencias Naturales e Ingeniería
Departamento de Ciencias Básicas
Química Analítica e Instrumental
Guía de laboratorio No. 7
Principios de cromatografía
Cromatografía en capa delgada, columna y HPLC

I.
1.
2.
II.

OBJETIVOS
Separar los pigmentos de una muestra vegetal por medio de técnicas cromatográficas.
Cuantificar la cantidad de etanol presente en una muestra de licor, usandoHPLC.
FUNDAMENTO TEORICO.

La historia de la cromatografía moderna se remonta a los estudios del botánico ruso Mikhail Tswett, quien
utilizó una columna rellena de carbonato de calcio (fase estacionaria) para separar pigmentos coloreados de
extractos vegetales. La muestra se colocaba en la parte superior de la columna y se hacia pasar a través del
carbonato de calcio usando éter de petróleo (fasemóvil). A medida que el solvente se desplazaba, los
pigmentos se empezaban a separar en bandas coloreadas, luego se sacaba de la columna el carbonato, se
cortaba y cada pigmento se extraía por separado. Tswett denominó esta técnica cromatografía, por la
combinación de las palabras griegas que significaban “color” y “escribir”. Después de 1931 esta técnica
analítica tomo interés para las separacionesbioquímicas gracias a los trabajos de Martín y Synge (1941), y
por los cuales fueron merecedores del premio Nobel de Química en 1952.
En resumen, la cromatografía es una técnica en la que se separan solutos debido a la distribución diferencial
de estos, entre la fase móvil y la estacionaria.
Las separaciones se pueden clasificar en tres formas:
- según el estado físico de la fase móvil y de laestacionaria
- según el método de contacto entre las fases
- según los mecanismos físicos o químicos responsables de la separación
La fase móvil suele ser un líquido o un gas (cromatografía líquida o cromatografía de gases) y la fase
estacionaria es un sólido o una película líquida que reviste una superficie sólida. Para poner en contacto la
fase móvil y la estacionaria se usan dos métodos, lacromatografía de columna (CC) donde la fase
estacionaria se empaca en una columna estrecha por la cual pasa la fase móvil, por efecto de la gravedad o
de una presión aplicada. La cromatografía de capa delgada (CCD), la fase sólida cubre una lámina plana de
vidrio, metal o plástico, que se coloca en contacto con la fase móvil y esta se desplaza por capilaridad.
El mecanismo por el que los solutos se separanse pueden catalogar en cromatografía de adsorción y
cromatografía de reparto; en la primera los solutos se separan según la capacidad para adsorberse sobre
una fase estacionaria sólida, y en la segunda, la separación se debe a la diferencia del equilibrio de reparto
(solubilidades) entre la fase móvil líquida y la fase estacionaria (película líquida). También la separación se
puede deber a lasinteracciones electrostáticas entre la fase estacionaria y los solutos (cromatografía de
intercambio iónico); por la interacción entre los solutos con las cavidades porosas de un gel (cromatografía
de exclusión por tamaño), y por la formación de enlaces específicos entre la fase estacionaria y los solutos
(cromatografía de afinidad).

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Principios de cromatografía
Cromatografía en capa delgada, columna y HPLC

III.

MATERIALES Y REACTIVOS.

Cada grupo debe tener:
-

Un mortero con mano
Un vidrio de reloj
Una espátula
Dos Pipetas graduadas de 10 mL
Dos erlenmeyer de 50,0mL
Cuatro vasos de precipitados de 50 mL
Un embudo de vidrio mediano
Una pipeta Pasteur conchupa
Una pipeta Pasteur sin chupa
Un agitador de vidrio
Una nuez
Una pinza para refrigerante pequeña
Dos goteros plásticos limpios y secos
Un triangulo de porcelana
Dos cortes de gasa
Dos capilares
Un tapón de caucho con hueco (para que se coloque la pipeta Pasteur)
1 Micriopipeta de 10 a 100µL
1 Micriopipeta de 100 a 1000µL

Material y reactivos de uso general:
- Etanol al 96%
- n-Hexano
-...