guia analisis instrumental

Bio 369
Laboratório de Análisis Instrumental.

Experimento N° 2
Cinética enzimática
Fundamento teórico:
Se determinarán los parámetros cinéticos (velocidad máxima (V) y constante de
Michaelis(KM)) de la enzima β-glucosidasa de Penicillium purpurogenum. Para ello se
determinará la actividad específica de la enzima a concentraciones crecientes de sustrato,
que van desde 0 a 4 mM.
Paradeterminar la actividad específica se utilizará el sustrato artificial p-nitrofenil β-Dglucopiranósido (pNPGlu) que por acción de la β-glucosidasa libera p-nitrofenol, el cual
se cuantifica a 405 nm enel espectrofotómetro.

Figura Nº 1: A la izquierda se ve una representación esquemática del p-nitrofenil β-D-glucopiranósido y a
la derecha se muestra el sitio de corte de la β-glucosidasa y laliberación de p-nitrofenol.

Con las concentraciones crecientes de sustrato y la respectiva actividad específica se
realizará la gráfica de saturación.

Figura N° 2: Gráfica que representa lacurva de saturación de una enzima.

Objetivos:
a) Preparar una curva estándar de p-nitrofenol en condiciones que permita
determinar posteriormente la actividad de la β-glucosidasa.
b) Determinar losparámetros cinéticos de la β-glucosidasa de P. purpurogenum.

Materiales:
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Micropipetas p1000, p200, p100, p20 y p10.
Puntas azules, amarillas y blancas.Gradilla y flotadores para tubos eppendorf.
Tubos eppendorf de 1,5 ml y lápiz marcador.
Amortiguador citrato y carbonato de sodio.
p-Nitrofenol (pNP), HCl y NaOH.
p-nitrofenil β-D-glucopiranósido(pNPGlu).
Balanza, agitador magnético y pHmetro.
3 Vasos precipitados de 100ml.
3 probetas de 100 ml.
magneto, caña y espátula.
agua destilada.
Baño termoregulado a 30ºC o estufa a esatemperatura.

Averigüe previo al laboratorio:
-Valor de parámetros cinéticos de la enzima en estudio (Hidalgo, M., Steiner, J. y Eyzaguirre,
J. (1992) β-glucosidase from Penicillium purpurogenum:...