Hibridacion En Situ

Hibridación fluorescente in situ

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Hibridación fluorescente in situ
FISH o hibridación fluorescente in situ es una técnica de marcaje de cromosomas mediante la cual los cromosomas son hibridados con sondas que emiten fluorescencia y que gracias a ello permiten la visualización, distinción y estudio de los cromosomas así como de las anomalías que puedan presentar. Esta técnica permite larápida determinación de aneuploidías, microdeleciones, duplicaciones, inversiones, así como la adjudicación de un marcador genético a un cromosoma (cartografía genética).

FISH metafásico en humanos. En amarillo, el cromosoma 2.

Los cromosomas que son usualmente utilizados con FISH son los 13, 18, 21, X e Y; sin embargo, como son posibles marcados adicionales del cromosoma, otros cromosomaspueden ser visualizados con esta técnica. FISH usa segmentos de una única hebra de ADN que son tintados, o etiquetados, con una sustancia fluorescente que puede ligarse a un cromosoma específico; estos segmentos de ADN son llamados sondas. El primer paso de la técnica consiste en la desnaturalización del DNA para separar la doble hélice. A la muestra desnaturalizada se le añade entonces la sonda deinterés (fragmento de ADN marcado fluorescentemente). Primero, las sondas hibridan a regiones específicas. Después, se tiñen los núcleos con un color de contraste inespecífico (generalmente DAPI). Las sondas de DNA pueden marcarse con moléculas fluorescentes (método directo) o no fluorescentes que se detectan con anticuerpos fluorescentes (método indirecto). La técnica FISH puede realizarse a loscromosomas en metafase o en interfase.

FISH en metafase
En metafase se utiliza para detectar microdeleciones específicas, translocaciones o para identificar material extra de origen desconocido. Los tipos de sondas usadas son cósmidos,satélites alfas y sondas completas (painting probes). • Los cósmidos son secuencias únicas que hibridan con fragmentos pequeños. Se emplean en estudios demicrodeleciones. • Las sondas satélites están formadas por secuencias altamente repetidas que se encuentran cerca de lo centrómeros. En la mayoría de los casos son específicas de cada cromosoma. Se usan para determinar aneuploidias o para identificar el origen de cromosomas marcadores. • Las sondas completas consisten en la suma de varias sondas que hibridan en distintas zonas del cromosoma
FISHinterfásico en ratón.

Hibridación fluorescente in situ

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FISH en interfase
No siempre es posible tener núcleos fijados en metafase para realizar el FISH. Normalmente, cuando se fija una célula sin tratar el núcleo se encuentra en interfase, con los cromosomas descondensados. A pesar de ello, es posible realizar el FISH aunque los resultados obtenidos no sean tan específicos. Se emplea sobre todopara la detección de aneuploidias o grandes deleciones, duplicaciones o translocaciones en células fetales o tumorales.

Otros tipos de FISH
Además del FISH múltiple, está el FISH en hebra y el FISH inverso. En el FISH en hebra (fiber FISH o Halo FISH) se extiende linealmente en un porta el fragmento de cromosoma a estudiar. Esta técnica permite detectar pequeñas reorganizaciones. La técnicapuede ser usada para detectar deleciones en clones y para estimar huecos en los proyectos genoma. Por su parte, el FISH inverso es una técnica que se usa mucho para determinar la procedencia de un cromosoma marcador. Este tipo de FISH tendrá la peculiaridad de ser el ADN problema el que se marque. El procedimiento consiste en recortar un fragmento de cromosoma o dicho cromosoma marcador de un portadonde se encuentran todos los cromosomas fijados. Se encuentran teñidos con Giemsa o con una sonda, esto sirve para marcar ese ADN y convertirlo en una nueva sonda. A continuación, ponemos los cromosomas de un donantes sin anomalías (normalmente será un varón para contemplar todas las opciones, es decir, tener los cromosomas X, Y) en un porta y añadimos la sonda preparada. Esperamos ver que...