hibridacion

Hibridación
La hibridación in vitro es un fenómeno importante y muy utilizado en todas las áreas de la biología molecular. Recuerda que la temperatura (y algunos agentes químicos) pueden desnaturalizar el DNA de forma reversible siempre que la temperatura (o la sustancia) disminuya lentamente. Si se hace descender bruscamente, cada hebra de DNA tiende a re asociarse consigo misma y formar unovillo que se estabiliza por fuerzas intermoleculares. Como consecuencia, se obtiene un DNA sin utilidad y cuya absorbencia es menor que el desnaturalizado, pero mayor que como ds DNA.
Principios básicos
La hibridación entre secuencias se basa en la especificidad de la interacción entre las bases nitrogenadas de distintas cadenas, de manera que se favorezca su asociación y se disminuya laposibilidad de re asociaciones intracatenarias así como las hibridaciones inespecíficas. Para empezar, hay que contar con una secuencia diana (target) dentro de un fragmento de DNA y con una sonda (probé), que no es más que un fragmento pequeño de DNA de secuencia conocida y complementaria a la secuencia de diana. Cuando la sonda y la diana se encuentran, el dúplex se identifica con radiactividad,fluorescencia o colorante, según de la manera en que la sonda se haya marcado.
El DNA a hibridar debe digerirse previamente con una o varias enzimas de restricción para dar lugar a una serie de fragmentos individualizados que se pueden resolver en una electroforesis en un gel de agarosa. Este gel de agarosa se «replica» sobre un filtro de nitrocelulosa o nilón mediante la transferencia (blof) del DNAdesde el gel hasta el filtro. Esta transferencia se produce por capilaridad desde el gel hasta el filtro. También se han desarrollado métodos rápidos por transferencia al vacío. Para que el DNA se transfiera es necesario sumergir el gel en una solución alcalina, de manera que éste de desnaturaliza al romperse los puentes de hidrógeno. La desnaturalización del DNA es esencial para que, posteriormente,la sonda pueda encontrar su secuencia complementaria. Si el DNA a transferir es de gran tamaño, entonces conviene dar antes un tratamiento con rayos UV o una solución ácida para introducir mellas que permitan que los fragmentos difundan a través de la agarosa. A continuación, el gel se neutraliza para permitir que el DNA desnaturalizado se transfiera como cadenas sencillas a la membrana.
Unavez inmovilizado el DNA sobre el filtro, se rastrea (screening) el fragmento con la sonda específica. Se forman así una serie de DNA híbridos bicentenarios cuya estabilidad va a depender de la cantidad de bases apareadas: cuanto más larga es la sonda y más bases se aparean y más estable es el híbrido. En general, a mayor grado de hibridación, mayor conexión evolutiva entre especies, y viceversa.Control de la hibridación
La especificidad de la hibridación se puede modificar mediante:
• La cantidad de GC que tiene la secuencia que se hibrida: a mayor %GC, más fuerte resulta la hibridación y más alta será la temperatura a la que se pueden hibridar para garantizar la especificidad de la hibridación.
• También influye la composición de bases de la sonda, ya que a mayor %GC, más fuerteresulta la hibridación.
• El número de copias de la secuencia de diana es clave, puesto que un número demasiado bajo hace que la técnica no tenga suficiente sensibilidad como para que, después de haberse hibridado la sonda con la diana, podamos detectar tales híbridos.
• La concentración de la sonda es también clave por la misma razón que la anterior.
• El tamaño de la sondaba a permitir que sehibriden suficientes pares de bases de manera que el híbrido sea suficientemente estable para que se pueda detectar y no se deshaga durante las manipulaciones. Con unos cientos de pb basta: por la forma en la que se preparan las sondas (son fragmentos de la plantilla), no suele tener sentido elegir sondas de varios kilos bases de longitud.
• El rigor (stringency) de la hibridación. Con este concepto...